肝豆状核变性的肝脏病理及超微结构研究进展

  肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration，HLD)又称Wilson Disease(WD)，是一种常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病，也是少数几种可以治疗的神经系统遗传性疾病之一。目前世界各地患病率不一，据报道约为0．3～3／10万  。在我国的发病率并不少见，朱氏等回顾性分析2001年1月--2010年12月进行肝脏活体组织病理检查的儿童非病毒性肝病703例，非病毒性肝病疾病谱为66种，以肝脏代谢相关性疾病最多(46．23％)(其中单病种以肝豆状核变性最多(48．92％))  。
    肝豆状核变性基因突变引起的ATP7B功能缺失，可导致铜蓝蛋白合成障碍、胆汁排铜障碍、金属巯蛋白基因及其调节基因的异常以及溶酶体缺陷等生理机制异常  ，导致铜在全身各脏器的沉积，大量的铜先沉积于肝脏，当肝脏内铜饱和后，铜又可在脑、骨及肾脏等组织内沉积，从而引起一系列脏器病变   。而肝脏是体内铜中毒的原发靶器官和铜主要沉积的部位。因体内铜沉积的部位和数量存在一定的个体差异，造成以肝、脑等脏器为主的全身功能损害，产生复杂多样的临床表现，临床上以肝细胞损害、脑退行性病变和角膜边缘铜盐沉着环、急性血管内溶血、肾脏损伤等为主要临床特征。而肝脏病变不仅是HLD患者最主要的病理改变，也是患者死亡的最主要的原因之一。在此对肝豆状核变性在肝脏的病理改变及其超微结构的进展研究进行综述。
    动物模型
    陈曦等  选取l～6个月的每月龄TX小鼠和同系DL小鼠雌雄各3只，分别作为病例组和对照组，光镜下主要为变性坏死，胞核空泡样变。自病程第3个月起，肝细胞大小不一，丧失了正常的肝索结构，可见肝细胞脂肪变性、玻璃样坏死和胞核空泡状，4个月时最为显著。电镜下观察超微结构见线粒体嵴模糊、肿胀、基质中见电子致密物沉积，溶酶体中亦有大量颗粒样电子致密物。石铸等  研究TX小鼠以及同系DL小鼠分别作为病例组和对照组，观察TX小鼠的肝脏包括左叶、右叶、中叶和尾叶与正常对照相比，颜色灰黄，质地较韧，但大小正常，表面光滑，无结节状增生。组织学观察肝细胞排列紊乱，丧失了正常的肝索结构，部分肝实质细胞肿胀呈玻璃样改变，细胞质内含有较多脂滴，细胞核肿大甚至表现空泡状，另有部分肝细胞为双核。同时可见肝血窦或肝索内有增生活跃的卵圆细胞，胞核较小，细胞体积约为正常肝细胞的1／4左右。肝血窦内有较多的淋巴细胞浸润，超微结构观察电镜下见肝细胞排列紧密，可见桥粒。细胞大小不均一，粗面内质网有断裂现象，线粒体增多肿胀，溶酶体可见典型的板层结构并有大量的电子致密物沉积；细胞核大且大小不等，核形不规则，异染色质边集浓染。TX小鼠的遗传背景、铜生化特征以及病理特点与Wilson病相似，而且TX小鼠肝组织光镜下表现为为小结节样肝细胞增生，细胞排列紊乱。这些增生肝细胞多成对附着于肝板结构，有的为双核；原有肝实质细胞则表现为肿胀、细胞质内含有较多脂滴，混杂生长以至肝组织的正常肝板结构丧失，血窦中有大量的炎性细胞浸润，与人Wilson病的肝组织病理改变相似。究其原因，可能是因为铜离子是一种具有活跃的氧化还原能力的金属离子，具有类似Fenton反应的重金属毒性作用。当胞内铜离子含量增高时，产生大量的羟自由基，直接损害细胞质内的各种细胞器如线粒体、内质网出现相应的形态学改变，引起肝细胞发生肿胀、甚至玻璃样改变  。
    临床研究
l光学显微镜
    在无症状患者的活检标本中  ，肝脏组织改变通常很明显，这种改变甚至可发生在10岁以内的儿童。光学显微镜下最早可观察到的病变是汇管区肝细胞核的糖原样变性和中度脂肪浸润。由甘油三酯组成的脂滴的数量和体积进行性增加，与酒精性脂肪变性类似。肝脏由脂肪浸润到肝硬化这一过程的变化速度个体差异很大。某些患者可发生慢性活动性肝炎，可有单核细胞浸润，多数为淋巴细胞和浆细胞，可有碎屑样坏死，并且这种坏死可越过界板，可有肝实质塌陷，桥接样坏死和肝纤维化，这可与慢性活动性肝炎相鉴别。肝脏病变可自然缓解，可进展为大结节性肝硬化或很快发展为暴发性肝炎。在肝硬化形成过程中可能有肝实质的炎性细胞浸润或实质坏死，最终形成大结节性或大结节小结节并存的肝硬化，纤维分隔可宽可窄，胆管增生，还可伴有Wilson病早期的一些病理变化如核糖体变性、脂肪变性等。伴有厚的或薄片状的纤维间隔(主要由I型和Ⅲ型胶原组成)，胆管增生和不同程度的圆形细胞浸润。在结节周边，肝细胞内常出现Malloy小体。所有肝硬化前期的病理变化，特别是细胞质脂质增加和胞核内出现糖原，也可以在硬化的肝脏中出现。Schein—berg   等对200多例HLD肝脏组织光镜观察，除1例3岁半的男孩肝活检光镜检查正常外，其余无一例正常，在对无症状少年HLD的肝组织病理检查发现：早期肝脏异常病理改变是轻度类脂质小滴沉着。随着病程的进展，脂质小滴的量和体积都逐渐增加，肝脏脂肪变性改变颇似酒精中毒引起的脂肪变性，随着病灶扩展，可发生枯否氏细胞增生和少量单核细胞浸润，随后门静脉系统周围胶质增生、小叶中心静脉周围纤维化，这些早期改变可进一步发展为无症状性肝硬化。StromeyerL~oj等对34例HLD患者的病理研究，发现7例呈早期改变，表现为肝细胞多形性、脂肪变性、核空泡及灶性坏死；4例呈慢性活动性肝炎改变，除上述病理改变外，还表现为肝细胞内糖原蓄积，界板界限不清，增生的胆管周围被炎细胞和纤维组织围绕，并有肝硬化；其余患者均表现为大结节性或大、小结节混合性肝硬化。罗政等  在10例肝组织穿刺病理检查时发现均有不同程度的病理改变大部分病例表现为肝细胞排列紊乱肝细胞轻度到重度肿胀肝细胞程度不等脂肪变性肝细胞内可见小泡微泡或大小泡混合，2例见Mallory小体年龄为12岁和14岁汇管区及小叶内可见大量的淋巴细胞及纤维组织增生7例首诊时肝脏已有假小叶形成年龄最小的为7岁年龄大于15岁患者均有假小叶形成且就诊年龄越大肝细胞排列越紊乱脂肪变性越重。陈源等   对1例亲体部分肝移植术后摘除的肝豆状核变性的肝脏组织进行病理及超微结构研究，均提示患儿肝脏进人肝硬化阶段，在光镜：典型假小叶形成，大部分假小叶中央静脉缺如，假小叶内细胞大小不等，存在不同程度的变性坏死，细胞融合。部分细胞核碎裂消失。肝细胞在镜下表现为大小不等，呈多样化，部分细胞融合、空泡样变。胞质颗粒粗糙，分布不均，呈团块状，部分核碎裂、消失。汇管区内肝动脉内皮细胞变性，肌层坏死。胶原纤维增生明显，其间散在淋巴细胞的浸润。
2  电镜及免疫组织化学观察
    肝细胞线粒体明显异常，与脂肪变性同时存在或早于脂肪变性，其发病机制可能与脂肪变性有关。线粒体在大小和形状上有明显的不一致性，如基质密度增加，正常靠近的内外线粒体膜分离，嵴间空间增大，基质中出现一些空泡和晶体包涵体或致密包含体。尽管这些异常也可见于其他疾病，但是在同一线粒体同时出现上述几种异常对年轻的肝豆状核变性患者来说是特异性的。电镜下肝细胞内线粒体的变化被认为是最特异、最具有病理诊断价值的。线粒体大小及形态不一，基质密度增加，内、外层膜分离和嵴间距增宽等改变，同时可见基质内有空泡状或结晶状包涵体；出现大而不规则的、高电子密度的溶酶体，内含大小不一的致密颗粒和低密度脂滴，有界膜包绕，部分界膜不清，组织化学证实有大量铜沉积；过氧化酶体形态不一，且其基质呈颗粒状或絮状。经过数年青霉胺治疗，大多数病人的线粒体异常可减轻或消失，这间接地提示这些改变是铜中毒引起的。肝细胞肝窦面微绒毛减少，可见胞质内质网中的细丝状物通过大小不一的开口进入窦周隙，并伴有窦周隙胶原纤维增多。窦周隙内纤维母细胞及贮脂细胞增多，贮脂细胞和纤维母细胞的波形蛋白染色均呈阳性反应，提示二者是同一体系的细胞。贮脂细胞质内细胞器较为丰富，核两端细胞质内可见l～2个脂滴，密度中等，细胞周围有较多的胶原纤维，说明贮脂细胞具有合成胶原的能力。在肝窦与窦周隙之间可见基膜形成，Ⅳ型胶原染色呈连续性阳性反应。部分肝细胞间胆小管及两相邻肝细胞接触面微绒毛增多，方向不一，并伴有桥粒增多，部分肝细胞间出现束状胶原纤维。肝细胞质内糖原颗粒减少，可见灶性嗜锇性膜样结构。肝细胞核部分空泡变，部分核团缩、核溶解、有的出现核仁分离  。胡闻等   取肝豆状核变性患者肝细胞，通过台酚兰染色示即时存活率可达95％。肝细胞培养7d后细胞存活率可达90％，在透射电镜下观察可见肝豆状核变性患者肝细胞质及溶酶体内有铜颗粒聚集。詹志刚等  发现在WD症状出现前较早的组织学改变有细胞核中糖原蓄积和不同程度的脂肪变性。疾病早期，电镜下即可发现特征性的线粒体变化，但非特异性和专一性WD诊断依据。肝细胞线粒体表现为大小不一，正常位于膜内或膜外的线粒体嵴被分离，嵴内腔隙增大。随疾病发展，铜蛋白分散于溶酶体内可见到电子致密的管周颗粒。随着光学显微镜下的变化日益加重，这些超微结构变化不太突出。铜的肝组织化学染色一般没有诊断眭价值。疾病早期，铜主要分布在细胞质中，硫氰酸染色不易发现；当疾病发展到肝硬化时，铜的片状分布和较少的再生颗粒可导致活检时取样错误，而且其他的肝病也可出现可染色铜(如原发性肝硬化、硬化性胆管炎、胆道闭锁)。一些病人的临床表现和肝组织检查酷似自身免疫性疾病或慢活肝。10％～20％病人可出现慢活肝，这些病人的肝组织与其他的慢活肝不易区分：也有淋巴细胞、浆细胞所组成的单核细胞浸润、点状坏死和纤维化。据推测35岁以前患慢活肝的病人中，5％是由WD所引起，WD所致慢活肝的鉴别特征为中度的转氨酶升高，不能反映组织炎症的严重程度。不幸的是，最多见的肝表现为肝硬化的发展。WD发展为肝纤维化和肝硬化的概率不同，肝硬化一旦发生可为大结节、小结节或混合性，可见纤维化中隔、胆管增生、马洛里透明小体。张巧英等  报道l例经皮穿刺活检肝豆状核变性肝组织超微结构特征，组织学电镜检查发现肝细胞内出现多量形态不一的异常或畸形线粒体和脂褐素颗粒；其中特征性变化是线粒体内出现线条状结晶体和脂褐素颗粒内形成透明小体。提示肝细胞内出现线条状结晶体的线粒体和形成透明小体的脂褐素颗粒，对肝豆状核变性的诊断具有价值。肝脏的组织学检查只能判断肝豆状核变性患者肝脏的损伤程度。国外有研究认为在肝豆状核变性的早期(无症状期)，肝脏内已经出现线粒体明显形态异常。陈源等   对1例亲体部分肝移植术后摘除的肝豆状核变性的肝脏组织行HE、MASSON、TIMM、PAS染色，电镜进行肝细胞超微结构观察。结果Timm’s染色阳性，发现不均匀分布黑色颗粒或团块样物质沉积，以门脉区以及假小叶内肝细胞为甚；PAS染色则除假小叶外普遍缺乏特异性染色；而超微结构观察显示肝细胞细胞膜部分溶解，胞质普遍高度水肿，存在高电子密度的物质。细胞核核膜外层突起，核周隙轻度扩大。线粒体形态多样，体积增大，均存在不同程度水肿，内、外膜分离。线粒体嵴扩张、排列紊乱，部分或大部分消失。溶酶体增多，体积增大，内含粗糙颗粒，可见不同阶段的初级和次级溶酶体。粗面内质网腔轻至中度扩张，脱颗粒。细胞外胶原纤维增生明显，可见成束状增生的胶原纤维。肝豆状核变性患儿的细胞器损伤，最特征性的改变是线粒体形态改变和脂滴的存在  。线粒体损伤早期就可以出现，在肝细胞内，线粒体是自由基作用的最主要靶器官，脂质过氧化反应的后果，会因为消耗大量的不饱和脂肪酸使膜结构损害，导致线粒体膨胀，脆性增加和通透性增强。在此次研究的结果中，线粒体形态多样，体积增大，不同程度水肿，双层膜分离，嵴扩张、排列紊乱或消失，门脉区的部分病理改变严重的线粒体只存在双层膜样结构。除门脉区外，肝脏其他部位的肝细胞内均存在大量脂滴，支持脂肪变性是病理改变的更早期过程。在肝细胞中，溶酶体在排铜过程中起重要作用，Goldfischer等   发现在无症状肝豆状核变性患者，肝细胞铜主要弥散在细胞质中，与金属硫蛋白结合存在。随病程延长，铜逐渐呈现溶酶体内分布的特点，为溶酶体的增多提供了合理依据。吴敏霞等  对l例患者行右肝实质穿刺活检术，电镜结果肝细胞的形态尚正常，突出的变化是线粒体形态和大小很不一致，可见长杆状、哑铃状、L形的线粒体，可见巨线粒体，基质电子密度增加，其内膜与外膜之间间隙和嵴内间隙增大；线粒体空泡化、嵴断裂、消失，偶见内外膜分离现象。肝细胞内可见特殊颗粒，高电子密度，颗粒中有大小不一的圆形透亮空泡，在肝细胞内分布不规则。部分肝细胞内可见大小不等的脂滴，位于肝细胞核的周边或者弥漫分布在肝细胞质内，有些肝细胞的大部分细胞质被较大的脂滴占据，糖原沿脂滴的周边分布，细胞核偏于一侧。肝细胞内可见脂褐素沉着，少数肝细胞内糖原溶解，肝细胞内偶见糖原颗粒。肝细胞表面微绒毛化明显，肝细胞间可见有胶原纤维束形成，毛细胆管扩张、增生，可见胆栓形成。可见淋巴细胞浸润肝细胞。肝窦贮脂细胞增生。汇管区可见胶原纤维和成纤维细胞增生，少量淋巴细胞浸润。符合肝豆状核变性的病理改变。
    分子病理学的研究
    WD的特征为铜代谢障碍，其发生的分子基础是ATP7B基因突变导致基因蛋白P-型铜转运ATP酶功能异常  。ATP7B是一个转运阳离子的P型ATP酶家族的新成员，在肝、肾、胎盘细胞中表达较高，尤其以肝细胞中表达为主。一般情况下，ATP7B定位在高尔基体外侧网络(Trans-Golgi network，TGN)上，该蛋白在这个位置的主要功能是参与合成铜蓝蛋白，可将铜离子转运到分泌途径，与原铜蓝蛋白结合(apoceruloplasmin)使其变为具有生物活性全铜蓝蛋白，或使铜排泄到胆汁中  。ATP7B基因突变可使其编码的ATP酶功能丧失或对核苷酸的亲和力降低，也可使酶错误定位，导致铜蓝蛋白合成减少或功能异常，不能清除体内多余的铜，肝脏、大脑、肾等器官和组织(尤其肝脏和脑组织)中出现大量的铜沉积。体内过多的铜诱导自由基反应和脂质过氧化反应，损伤肝细胞，引起脂肪变性和炎症，导致肝细胞死亡  。另一方面ATPTB亚细胞定位受细胞内铜离子浓度调控，铜离子浓度升高时，在其他铜转运蛋白的协助下将细胞内多余的铜离子以囊泡形式自肝细胞胆管面分泌进入胆汁进而排出体外。ATP7B基因突变使这一功能损害，多余的铜不能排出体外而致病。基因突变导致ATP7B转运铜功能的模式大致有3种  ：①ATPTB仍定位在TGN，但丧失了对铜的应答，如G943S位点突变损害了铜浓度调控的ATP7B细胞内定位变化，而铜蓝蛋白合成并未受影响，这可能是少数患者铜蓝蛋白未降低的原因  ；②ATP7B不在TGN，而是聚集在细胞边缘，转运铜出胞功能失调；③最常见也是临床致病最重要的模式，ATP7B滞留在内质网，容易被蛋白酶体降解，最常见的突变位点是H1069Q和Arg778Leu L23~24。。孙艳玲等  对48例临床资料完整并行肝穿刺检查的WiIson病例做临床和实验室资料分析。采用光镜观察、电镜观察、Rhodanine／Rubeanic acid铜染色及网状纤维和胶原纤维染色探讨WiIson病的病理学特点。肝脏主要病变表现为汇管区及小叶内不同程度慢性炎症及界面炎，肝细胞小泡／微泡或大、小泡混合性脂肪变性，77．0％肝细胞内呈较弥漫性铜颗粒沉积，以腺泡I带肝细胞为甚，可见大而不整的凋亡小体、糖原核肝细胞、MaIIory小体及嗜伊红颗粒肝细胞；超微观察示肝细胞内可见肿胀或怪异线粒体，溶酶体颗粒增多，并见泡状圆形包涵体。本组病例均存在不同程度肝纤维化，表现为早期汇管区扩大，中期纤维间隔形成及晚期肝硬化改变。活动性病变肝组织内，尤其在铜颗粒沉积明显区域活化HSC数目明显增加，凋亡减少，TIMP-1、TIMP-2表达量增强。
  肝豆状核变性是一种少见疾病，对于其病理研究较少，而且以肝脏的病理及超微结构研究多见，对于脑和肾脏等脏器的病理研究更少，尤其是分子病理学方面更为罕见。在对几种重要的遗传代谢性肝病的肝纤维化研究发现，肝纤维化普遍发生，肝豆状核变性和先天性肝纤维化的肝硬化发生比例明显高于其他遗传代谢性肝病。在未发生肝硬化的病例中，肝豆状核变性发生的纤维化程度也高于其他遗传代谢性肝病  。    
    目前，有关肝纤维化的研究已经进入到了分子病理学水平，已经认识到肝纤维化成为阻止发展肝硬化过程中唯一可靠的治疗时机，肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理基础与特征，表现为以胶原为主的肝脏细胞外基质(extracellular matrix，ECM)各成分合成增多，降解相对不足，过多沉积在肝内。肝豆状核变性存在肝纤维化也是肝脏受到慢性损伤时ECM可逆性沉积的创伤愈合过程。但是，如果认为在各种原因所制的肝纤维化中HSC所发生的反应是一样的，这种观点可能过于简单化，如在病毒性及酒精性肝损伤中，HSC的反应可能表现出微小的，然而可能是非常重要的差别，这种差别还可能同治疗有着密切关系  。而目前细胞信号转导通路方面在肝纤维化的发生发展中起极其重要的作用，有望从分子病理学角度揭示肝纤维化的形成，从而为抗纤维化治疗提供方法。因此，重视对肝硬化特别是其前期病理阶段——肝纤维化的研究具有十分重要的临床意义。而Wilson病致肝纤维化机制的研究几乎是空白，而很多Wilson病患者的治疗在出现肝纤维化时进行逆转，结合病因的治疗，将会大大提高患者的生存率和生活质量如果。近年来肝卵圆细胞作为一种可能的肝前体细胞而受到极大的重视  。是否肝铜沉积引起的慢性肝损害微环境会促进卵圆细胞的增生还未有定论，但毫无疑问，这提示通过肝前体细胞移植来治疗Wilson病有着广阔的前景。