载脂蛋白A-Ⅰ对三磷酸腺苷结合盒转运体A1的影响
唐朝克 姜志胜 易光辉 王佐 刘录山 任 重 王 双 杨永宗
南华大学心血管病研究所
国家自然科学基金资助项目 (30470720)
前 言
三磷酸腺苷结合盒转运体(ABC)超家族, 目前已发现有七个家族, 分别为A、B、C、D、E、F、G, 它们共有48个成员，A家族共有12个成员, ABCA1是A家族成员之一。它的主要功能与促进细胞内胆固醇流出有关。
负荷乙酰化低密度脂蛋白胆固醇酯的人单核源性巨噬细胞其ABCA1蛋白质增加似乎与ABCA1 mRNA增加不均衡。
巨噬细胞ABCA1蛋白质降解非常迅速。这些结果说明ABCA1蛋白质降解在ABCA1功能调节中起作用。
ABCA1横接于apoA-I，这就产生apoA-I调节ABCA1降解的可能性。
技 术 路 线
THP-1巨噬细胞
加ox-LDL
THP-1巨噬细胞源性泡沫化
载脂蛋白A-Ⅰ
胆固醇流出检测、油红O染色、高效液相色谱分析、流式细胞术、RT-PCR、Western 印迹检测等
实验方法
1、 细胞培养
2、 LDL的分离、修饰及鉴定
3、胆固醇流出实验
4、油红O染色
5、高效液相色谱分析
6、流式细胞术
7、逆转录聚合酶链反应
8、Western 印迹检测
9、统计学处理
结 果
1 THP-1巨噬细胞源性泡沫化
THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇和胆固醇酯的检测
2 载脂蛋白A-Ⅰ对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇的影响
*P<0.05 νs 0 h group or BSA group and control group
*：P<0.05, 与0h组比较
3 载脂蛋白A-Ⅰ对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响(n=3)
4 载脂蛋白A-Ⅰ对THP-1巨噬细胞源性 泡沫细胞ABCA1表达的影响
0h 6h 12h 24h BSA control
0h 6h 12h 24h BSA con M
*: P<0.05, 与0h组比较
5 载脂蛋白A-Ⅰ对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞
平均ABCA1荧光强度的影响
0h
6h
12h
24h
BSA
control
31.4
30.9
42.6
38.7
32.4
31.2
6 蛋白酶抑制剂对ABCA1蛋白质降解的影响
1 2 3 4 5 6 7 8
1: 10 μg/ml apoA-I; 2:10 μg/ml apoA-I﹢50 μmol/L ALLN; 3:10 μg/ml apoA-I﹢500 μg/ml leupeptin; 4:10 μg/ml apoA-I﹢20 μmol/L pepstatin A; 5:10 μg/ml apoA-I﹢10 μmol/L aprotinin; 6:10 μg/ml apoA-I﹢250 μg/ml phosphoramiddon; 7: 10 μg/ml apoA-I﹢5 μmol/L lactacytin; 8:10 μg/ml apoA-I﹢5 mmol/L NH4C1. * P<0.05 νs control group
2, 3 巯基蛋白酶抑制剂
4,5,6 蛋白酶抑制剂
7 蛋白体抑制剂
8 溶酶体抑制剂
* *
7 apoA-I和巯基蛋白酶抑制剂协同增加THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出
1: control group; 2: 2.5 μg/ml apoA-I group; 3: 5 μg/ml apoA-I group; 4: 10 μg/ml apoA-I group; 5: 20 μg/ml apoA-I group; 6: 50 μmol/L ALLN group; 7: 10 μg/ml apoA-I+ 50 μmol/L ALLN group. * P<0.05 νs control group
*
*
*
*
*
8 蛋白酶抑制剂对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响
1: 10 μg/ml apoA-I; 2:10 μg/ml apoA-I﹢50 μmol/L ALLN; 3:10 μg/ml apoA-I﹢500 μg/ml leupeptin; 4:10 μg/ml apoA-I﹢20 μmol/L pepstatin A; 5:10 μg/ml apoA-I﹢10 μmol/L aprotinin; 6:10 μg/ml apoA-I﹢250 μg/ml phosphoramiddon; 7: 10 μg/ml apoA-I﹢5 μmol/L lactacytin; 8:10 μg/ml apoA-I﹢5 mmol/L NH4C1 (n=3). * P<0.05 νs control group
*
*
2, 3 巯基蛋白酶抑制剂
4,5,6 蛋白酶抑制剂
7 蛋白体抑制剂
8 溶酶体抑制剂
9 巯基蛋白酶抑制剂ALLN浓度依赖性增加巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出
1: 10 μg/ml apoA-I; 2:10 μg/ml apoA-I﹢10 μmol/L ALLN; 3:10 μg/ml apoA-I﹢20 μmol/L ALLN; 4:10 μg/ml apoA-I﹢30 μmol/L ALLN; 5:10 μg/ml apoA-I﹢40 μmol/L ALLN; 6:10 μg/ml apoA-I﹢50 μmol/L ALLN.
*
*
讨 论
本研究显示apoA-I增加细胞内胆固醇流出, 降低细胞内胆固醇聚积，引起THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞总胆固醇、游离胆固醇与胆固醇酯呈时间依赖性减少, 而ABCA1蛋白质水平、细胞平均ABCA1荧光强度以及细胞内胆固醇流出呈时间依赖性增加,但ABCA1 mRNA没有明显变化。
巯基蛋白酶抑制剂增加ABCA1蛋白质水平,而其它蛋白酶抑制剂不增加ABCA1蛋白质水平,蛋白体抑制剂和溶酶体抑制剂也不影响ABCA1蛋白质水平。巯基蛋白酶抑制剂阻碍ABCA1蛋白质的降解。因此, ABCA1蛋白质分解作用很可能由巯基蛋白酶介导的途径即钙激活中性蛋白酶来完成。
由于蛋白体抑制剂不影响ABCA1蛋白质水平, 所以蛋白体对ABCA1蛋白质分解作用可以被排除。溶酶体抑制剂不影响ABCA1蛋白质水平, 溶酶体也不大可能对ABCA1蛋白质起分解作用。apoA-I通过阻碍ABCA1蛋白质降解, 而增加THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1蛋白质水平。
因此, 载脂蛋白通过阻碍ABCA1蛋白质降解途径来稳定ABCA1蛋白质并导致THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1蛋白质水平增加。巯基蛋白酶的抑制可进一步增加ABCA1蛋白质水平和THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出。
结 论
载脂蛋白A-I可提高THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1 蛋白质水平, 增加细胞内胆固醇流出, 降低细胞内胆固 醇聚积。
参 考 文 献
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