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【摘要】 核心蛋白的乙酰化和去乙酰化是基因表达过程中重要的调控方式，而负责组蛋白乙酰化和去乙酰化的是一对功能相互拮抗的蛋白酶HAT和HDAC。HAT激活基因转录，而HDAC的功能相反，为抑制基因的转录,其功能异常被证实与肿瘤的发生和发展及缺氧状态下的血管增生有直接关系。在视网膜新生血管过程中，有多种物质与血管生成有关，其中作用机制比较清楚的是一些多肽类和蛋白质类的生长因子，如HIF-1、VEGF、FGF等。在一些研究中发现HDAC抑制剂能不同程度地抑制上述一些因子的促新生血管作用。综述了HAT和HDAC参与的组蛋白乙酰化，以及HDAC抑制剂与视网膜新生血管之间关系的最新进展。以期进一步阐明组蛋白乙酰化修饰酶的生物学功能以及HDAC抑制剂在抗视网膜新生血管中的作用。
【关键词】 组蛋白乙酰化；组蛋白去乙酰化酶抑制剂；视网膜新生血管
核心蛋白的乙酰化和去乙酰化是基因表达过程中重要的调控方式，而负责组蛋白乙酰化和去乙酰化的是一对功能相互拮抗的蛋白酶。组蛋白乙酰化转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)它们各自形成的基因转录调控复合物分别称为辅助激活因子(CoA)和辅助抑制因子(CoR)。在细胞核内组蛋白乙酰化和去乙酰化过程两者处于动态平衡，精确地调控基因的转录与表达。HAT乙酰化组蛋白氨基末端，舒展核小体结构，激活基因转录。而HDAC的功能相反抑制基因的转录，HDAC作为调控基因的关键蛋白酶，其功能异常被证实与肿瘤的发生和发展及缺氧状态下的血管增生有直接关系。通过对HDAC的抑制可达到治疗肿瘤及缺血缺氧导致的新生血管的目的。本文就组蛋白乙酰化和去乙酰化与基因转录的关系及其在缺血缺氧导致血管增生的研究作如下综述。
1 组蛋白乙酰化和去乙酰化与基因转录
1.1 组蛋白的乙酰化与去乙酰化与基因调控 染色质的基本单位是核小体。有核心蛋白（H1，H2A，H2B，H3，H4）及DNA组成。核心蛋白富含带正电荷的氨基酸与DNA具有较高的亲合性。每个核小体含H2A,H2B,H3，H4各2个形成1个八聚体。核小体组装过程中H3H4二聚体首先与DNA结合。然后，2个H2A/H2B异二聚体结合到H3 H4结合处的5和3DNA上，形成核小体。其中H1位于核小体的外部，约占核心组蛋白总量的1/2。组蛋白与DNA结合可保护DNA免受损伤。维持基因组的稳定性。核小体的结构修饰是DNA复制、转录、翻译和修饰过程中的关键步骤。
组蛋白氨基末端从核小体核心伸出，在组蛋白发生乙酰化时HATs把乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白N端特定部位的赖氨酸残基上，中和组蛋白所带的正电荷，减弱核小体中碱性氨基酸与DNA的静电吸引力，降低相邻核小体之间的聚集，染色质松懈，转录因子容易与DNA链结合，从而有利于基因的转录［1］。
目前，已有实验证明，组蛋白乙酰化的作用是维持染色质的开放结构。因此有利于转录因子与靶DNA结合，从而有利于基因的转录。组蛋白去乙酰化酶HDACs可移去H3 H4赖氨酸上的乙酰基，使带正电荷的赖氨酸残基暴露，增强与DNA的相互作用。而带正电荷的赖氨酸残基与DNA之间的相互作用可限制核小体在DNA之间的移动，使启动子接近转录调控元件，组蛋白低乙酰化使染色质失去转录活性，因此抑制基因的转录［2］。
1.2 HATs和HDACs 根据组蛋白乙酰转移酶（HAT）的来源和功能将其分为两类：A类和B类HAT。A类HAT位于核内，其催化的乙酰化事件与转录相关。B类HAT在细胞之内，催化的乙酰化事件与新合成组蛋白F 4次从胞质转运到核内，并沉积在新复制的DNA上的过程有关［3］。目前为止，共发现15种蛋白质具有HAT内源性活性。根据结构，人们将其分为两个家族［4］：GNAT家族和MYST家族。GNAT家族即GCNS相关的N端乙酰化转移酶（GCNS-relatad-acetytransferas，GNAT），MYST家族包括MoZ、YbFZ、Sas3、Sas2、Tip60等组成的具HATs活性的蛋白质。多数HATs在染色质的基因转录和修饰中具有重要作用，使基因更容易表达其活性。
HDACs的作用与HATs相反，它可通过对组蛋白去乙酰化使DNA结构更加紧密。从而抑制某些基因的转录表达。人的HDAC主要分为3类：第1个被鉴定的人组蛋白去乙酰化酶与酵母的RPD3相关。它们的结构相近，被归类为第1类去乙酰化酶（class Ⅰ HDAC）这一类主要包括HDAC1～3和8［5～8］。第2类组蛋白去乙酰化酶（class Ⅱ HDAC）与酵母的HDA1有关，包括HDAC4～7，9，10［9,10］。它们的催化区域与酵母的HDA1蛋白同源。最近发现，酵母的SIR2(silent information regulator 2)也是一种组蛋白去乙酰化酶。人细胞中的SIR2同源物已经被鉴定出来。因此，SIR2及其相关蛋白构成了高等真核生物的第3类去乙酰化酶(class Ⅲ HDAC)在人中的有7种SIR2同源物，分别为SIRT1～7［11］。迄今为止，在哺乳动物细胞中共发现8种HDAC，包括HDAC1～8。HDAC除通过对组蛋白乙酰化来抑制基因的表达。它还可同时对转录因子如：P53、GATA-1、TFIIE和TFIIF进行乙酰化作用，调节基因的表达。HDAC还可参与细胞周期的调控，其中RB对转录因子E2F的转录抑制就是通过募集HDAC1和HDAC2来实现的。总之，在细胞内组蛋白乙酰化与去乙酰化处于动态平衡。催化组蛋白乙酰化的是组蛋白乙酰转移酶(HATs)催化组蛋白去乙酰化的氏族蛋白去乙酰化酶（HDACs）两者之间的动态平衡控制着染色质结构和基因的表达［12］。
1.3 CoA和CoR 对基因表达的调控还可以由HAT和HDAC的蛋白质复合物完成，前者称CoA，后者称CoR。CoA与一组活化的转录因子结合，通过组蛋白的乙酰化和募集基本转录复合物而激活特异性基因表达的复合物，主要成分为CBP腺病毒E1A相关蛋白，P300,P300/CBP相关因子(NcoA等)，它们都具有内在的HAT活性。CoR能与特异性转录因子结合。通过募集HDAC使核心组蛋白去乙酰化而抑制特异性基因的转录表达。CoR的主要成分有N-Co、SMRT、Sin3和HDAC、N-CoR、SMRT和Sin3的复合物与核受体Mad/Max的转录因子结合，通过Sin3募集HDACs到特异的基因调控区。通过组蛋白去乙酰化而发挥作用［13～15］。
1.4 HDAC抑制剂的作用机制和分类 HDAC抑制剂主要作用的机制是通过抑制HDAC阻断由于HDAC募集功能紊乱而导致的基因表达受抑制。从而达到治疗的目的。理想的HDAC抑制剂应具备以下特征：（1）抑制HDAC酶的活性；（2）使HDAC从靶基因启动子解离；（3）促进HAT定位于靶基因启动子。已有多种HDAC抑制剂被开发并在临床上得到应用。HDAC抑制剂按结构可分为4类：（1）短链脂肪酸，如丁酸钠；（2）氧奎酸类，如曲古菌素（TSA）SAHA(saberoylanilide hydroxamic acid)等；（3）环形四肽类，如trapoxin A FR901228(FK228)和apicidm等；（4）苯酸胺类。其中丁酸钠及其异构体已进入实体瘤一期临床应用。FK228已被发现具备抑制HIF-1a活性的功能［16］。并且作为抗肿瘤制剂进入临床研究。
2 缺氧诱导视网膜血管增生及HDAC治疗新生血管的研究
成熟的视网膜出现新生血管常导致视力下降甚至视力丧失。视网膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)多见于糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变。缺血性视网膜静脉栓塞病因复杂，发病机制尚未十分明确。近年来的研究发现，视网膜在缺氧时会引起血管旁的神经胶质细胞分泌血管内皮生长因子。血管内皮生长因子的生成增加将刺激视网膜血管的继续发育及新生血管的生成［17］。迄今为止已发现多种物质与血管生成相关，其中作用机制比较清楚的是一些多肽和蛋白质类的生长因子如：VEGF、FGF、PD-ECGF等。其中FGF、VEGF与缺氧关系密切能特异促进血管内皮细胞分裂而备受关注。
2.1 缺氧诱导因子与新生血管 缺氧诱导因子1（hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1）为异二聚体转录因子，由a亚基B亚基组成。两个亚基均属碱性多肽-螺旋-襻-螺旋（bHLH）转录因子家族中成员，并含有PSA（Per.ARNT.Sin）结构域。HIF-1B是HIF-1的结构性亚基，在细胞内的表达水平相对稳定。HIF-1a是HIF-1的功能性亚基，正常生理条件下一般检测不到。在特定诱导条件下细胞内HIF-1a水平增高并发挥作用。HIF-1a有2个氧依赖性降解区域（oxygen degradation domain,ODD）ODD介导HIF-1a经泛素-蛋白酶小体途径迅速降解。HIF-1a近C-末端和末端分别存在一个入核信号(NSL)介导其在低氧条件下入核。HIF-1a其C-端包含2个反式激活结构域(TADs)，分别为TAD-N和TAD-C。TAD-C能特异地结合P300/CBP即乙酰转移酶P300/CREB(camp response element-binding protein)结合蛋白（CBP）形成转录起始复合物。缺氧条件下HIF-1a降解受阻，细胞浆内HIF-1a积聚增多并发生核内转位，在细胞核中与HIF-1B结合形成HIF-1。HIF-1与目的基因的缺氧反应元件结合从而激活目的基因的转录过程［18］。如HIF-1作用于VEGF基因的缺氧反应元件（hypoxia responsefactor element，HRE）促使其表达增加，进而促进血管生成增加缺血缺氧组织的氧供。
2.2 VEGF与视网膜新生血管 近年来研究表明血管内皮生长因子（vascular endothelial groth factor）受缺氧调节的特性使它成为最重要的促新生血管形成因子。参与缺氧诱导有关的眼内新生血管形成［19］。VEGF是由相对分子量为34000～45000，二硫键结合的二聚体糖蛋白，是目前发现的对内皮细胞最具选择性的有丝分裂原。正常状态下，VEGF分泌量较低，在缺氧或某些病理状态下，视网膜细胞的VEGF mRNA表达明显增高已有研究表明［20，21］。VEGF的生物学效应是通过内皮细胞表面的2个酪氨酸激酶受体FLT-1和KDR来发挥作用的，内皮细胞受到VEGF刺激数秒钟后，细胞质内Ca2+浓度升高4倍以上，并且发生有丝分裂。经VEGF刺激后的内皮细胞S期细胞增多，G1期和G2+M期的细胞相对减少［22］。缺氧时，细胞通过其膜上的氧感应因子（oxygensensor）激活某一信号，此信号通过蛋白磷酸化作用后传递给HIF-1a基因上游的调控子第V因子。使HIF-1 mRNA表达增加。HIF激活VEGF和VEGF-1(flt-1)基因。VEGF-2(flt/FDR)基因也相继激活。VEGF和VEGFR结合引起血管内皮细胞增殖和诱导新生血管形成以适应缺血缺氧反应。
2.3 BFGF与缺氧条件下的视网膜新生血管 碱性成纤维生长因子(basic fibroblastic growth factorb，FGF)是一种碱性多肽，分子量为17～20KD对多种细胞的增殖分化功能具有强烈的调节作用。通常情况下，由内皮细胞合成的bFGF由于缺少传统的分泌性信号肽，主要储存在细胞质和基质分隔腔，不能以传统方式分泌。缺氧时，bFGF可以从损伤细胞中释放，途径可能是浆膜破坏释放或内皮细胞膜通透性增加。此外，缺氧时bFGF在细胞中的分布发生变化，以参与内皮细胞对缺氧的应答。常氧下bFGF散在均匀地分布在胞质和基质分隔腔。缺氧后，bFGF分布最明显的变化时核内环的出现和邻近核细胞着色增强。BFGF与受体结合后定位于细胞核，影响RNA聚合酶I，加强核蛋白体基因的转录，以加速细胞由G0～G1和G1～S期的转换，刺激细胞的DNA合成，促进细胞分裂和增殖。另外，bFGF能提高VEGF及VEGF受体在内皮细胞中的表达水平，当其和VEGF共同作用于内皮细胞时存在协同效应。BFGF能提高VEGF及VEGF受体在内皮细胞中的水平。Goto［23］等观察到，当这两种因子共同作用时，内皮细胞除增生反应明显提高外，三维生长的内皮细胞间形成管型的趋势也明显加强。
3 HDAC抑制剂在抑制血管增生的研究
在缺氧状态下，HDAC1～3表达增加。体内外实验均表明HDAC可抑制P53和VHL的表达却能上调HIF-1a和VEGF的表达水平。P53和VHL可促进HIF-1a的水解，抑制HIF-1a的促进基因转录作用［24，25］，抑制血管增生［26，27］。HDAC抑制剂，如TSA是第Ⅰ类和第Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶的抑制剂，能提高组蛋白H3 H4的赖氨酸的乙酰化水平，降低内皮细胞内的一氧化氮合成酶的活性而减少NO的生成进而抑制血管生成。另有研究证明，TSA能上调P53、VHL的基因表达水平，同时抑制HIF-1a表达及其DNA结合活性,进而降低VEGF等靶基因在缺氧状态下的表达水平。而且，TSA能抑制VEGF诱导VEGF的增加，同时能诱发VEGF的拮抗体Semaphorin Ⅲ的生成，通过这一系列作用，抑制血管的增生［28］。
Dimitrios Zgouras等在用Butyrate对人体结肠癌细胞研究中发现，Butyrate能够降低细胞内的酶蛋白体的活性，从而阻断了HIF-1a的泛素-酶蛋白体降解途径，导致HIF-1a在细胞质的积聚。但是，HIF-1a在细胞核中的表达却减少，且其DNA结合活性下降，同样导致VEGF的表达降低，而且VEGF促进内皮细胞形成管型的能力也下降［29］。
FK228具有更强的抑制新生血管的作用，它抗新生血管的有效剂量远低于其他HDAC抑制剂。如TSA、SAHA等［30］。FK228能使VEGF启动子的P2区的组蛋白H3、H4处在乙酰化状态，HIF-1的结合位点处于P2区，它在调节VEGF mRNA的表达十分重要。由于H3H4乙酰化状态抑制了VEGF的mRNA表达，FK228还能抑制bFGF mRNA表达，FK228明显抑制了血管的再生。
另有实验证明,FK228也能降低缺氧导致的VEGF HIF-1a水平［16］。FK228抑制HIF-1a的活性从而降低VEGF的转录和翻译水平。同时，也可抑制内皮细胞的增生和迁移［16,30］。You MeiLi等实验表明，在用FK228治疗的实体性肿瘤中，其缺氧区的一些新生的大血管和微血管发生萎缩。
4 小结
综上所述，病理条件下的视网膜血管的增生，是在不同条件和环境下的多种因素共同作用的结果。缺氧所致的视网膜新生血管是由多种因子参与的病理过程，这些因子有HIF-1a、VEGF、bFGF等。它们的作用不是相互独立，而是相互协同的。成熟的视网膜新生血管可导致视力的严重下降，甚至失明。而传统的对新生血管性和增值性眼病的治疗均不能从根本上解决问题。HDAC抑制剂能通过改变组蛋白的乙酰化程度来改变染色质的结构，从而达到调控基因的表达。最初用作抗肿瘤药物进行研究和应用，近年来的研究发现HDAC抑制剂具有较明显的抗新生血管作用。到目前为止，HDAC在缺氧诱导的血管增生的机制尚不十分清楚。HDAC在缺氧状态下过度表达，以及一系列的对HDAC抑制剂在抑制新生血管方面的研究表明。HDAC抑制剂是一种全新的肿瘤治疗和抗血管增生途径。HDAC抑制剂的开发有着极大的临床和社会价值。
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作者单位： 400010 重庆，重庆医科大学第二附属医院眼科
(编辑：陈 沁)