细胞周期抑制剂P27与胃癌

    【关键词】细胞周期抑制剂；P２７；胃癌

    细胞周期(cell cycle)是细胞生命活动的基本过程，细胞的增生、分裂、变形、凋亡和坏死等生理或病理过程都发生在它所处的细胞周期的某一时相；若细胞周期的某一时相出现异常，细胞将进入与之相关的病理过程。细胞周期受体内外多种因子、多层次调控。而细胞周期调控与肿瘤的发生、发展的关系密切。调控细胞增殖和分化的因素有多种，主要有细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinases,CDK)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin dependent kinase inhibitor,CDKI)。Ｐ２７是一种新发现的非特异性的周期素依赖酶抑制剂，对肿瘤细胞的增殖有重要的调控作用，与肿瘤的发生、发展密切相关，已成为近年来研究的一个热点。

    １P27的基因、蛋白结构特征

    P27基因定位于第12号染色体短臂１区3带(12ｐ１３），含有两个有编码功能的外显子和一个无功能的外显子及一个内含子。P27是由Polyak等［１］1994年在转化生长因子-β（ＴＧＦ-β）和细胞接触抑制导致的静息细胞Mvilu提取物中发现的，是相对分子质量为27000的热稳定蛋白，能与cyclinE-ＣＤＫ２、cyclinD-ＣＤＫ４及ｃｙｃｌｉｎＤ-ＣＤＫ６结合，并发挥其激酶抑制作用。人类的P27蛋白氨基酸顺序与鼠和貂的P27蛋白氨基酸顺序存在98%的同源性；P27ｃＤＮＡ长594ｂｐ，编码198个氨基酸，在N-末端与同家族中P２１蛋白具有42%同源性，与P57具有47%的同源性，这一区域具有两个Ser磷酸化位点，介导CDKs激酶活性的抑制，近C-端有一个双枝核定位信号，C-末端有一个Thr磷酸化点。与H1组蛋白磷酸化抑制作用有关。

    ２P27与细胞周期调控

    ２．１P27蛋白具有负性调节细胞周期、抑制细胞增殖的作用在正常情况下，P27蛋白在G０／Ｇ１期时表达增高，当细胞进入S期时则表达下降。P27蛋白高表达抑制细胞是一个普遍现象。P27蛋白在纤维母细胞中表达增高时，可使细胞周期停止于G１期，从而抑制增殖。P27基因转染细胞的过量表达，造成P27蛋白高度表达，可使细胞DNA合成强烈受抑，阻止其从G１期进入S期。研究发现，反义P27抑制P27蛋白在纤维母细胞中的表达，当P27蛋白减少90%时，开始启动DNA的合成。这些均表明P27蛋白在细胞周期调控中起重要作用。

    ２．２P27通过抑制cyclin-ＣＤＫ活性来调控细胞周期细胞是否由静止期重新进入细胞周期而增殖，主要取决于细胞内特异性CDKｓ的活性发挥，CDKｓ能否发挥则与其负性调节因子P27蛋白水解相关，P27蛋白通过抑制cyclin-ＣＤＫ复合物的活性来抑制CDKs的活性，从而负性调节细胞周期，抑制增殖。试验证实，P27主要是与周期素的结合而发挥对cyclin-ＣＤＫ的抑制作用［２］。P27对CDK的抑制作用有两方面，一方面P２７能抑制已结合到cyclin并被激活的CDK活性。纯化的P27蛋白能抑制各种已激活的cyclin-ＣＤＫ复合物活性，且通过抑制复合物中组蛋白H1激酶或GST-Ｒb融合蛋白的磷酸化而实现。另一方面P27也可以抑制CDK的激活过程，最终抑制细胞周期G１→Ｓ的转变，故目前认为P27是一个抑制因子。试验表明，P２７蛋白通过其Ｃ-末端抑制CDK４Ｔhr172和CDK2Thr160的磷酸化过程，从而抑制cyclin-ＣＤＫ４／ＣＤＫ２前活性状态复合物的激活。P27蛋白作为一种非特异性CDKI，以化学计量的方式抑制不同的cyclin-ＣＤＫ复合物，且抑制细胞增殖的关键是其在细胞内的游离量而非总量。虽然P27蛋白在细胞内也能抑制cyclinD-ＣＤＫ４复合物活性，但主要抑制cyclinE-ＣＤＫ２，只有当P27蛋白的水平超过与cyclinD-ＣＤＫ４复合物结合的水平时才表现出对cyclinE-ＣＤＫ２的抑制活性，使细胞不能通过G１期。P27基因转染细胞后，P27蛋白过量表达可使细胞DNA合成强烈抑制，阻止其从G１期进入S期，S期细胞减少。

    ２．３P27作为细胞外刺激信号的潜在媒介来调节细胞周期处于G１期的细胞接受胞外刺激后，有两种结果。一是经抗增殖信号刺激使其脱离细胞周期进入静止状态(G０期)；另一个是经有丝分裂原刺激使其通过G１期到S期进入下一个细胞周期［３］。P27蛋白是细胞外刺激信号和细胞周期状态之间的潜在媒介之一，胞外刺激信号可能通过调节P27蛋白的活性来调节细胞周期。Polyak等［１］发现TGF-β和细胞接触抑制诱导P２７蛋白水平升高，阻滞细胞由G１进入S期。Hoshino等［４］在研究中发现Ｐ２７表达上调对于肿瘤胞外信号调节激酶通路的特异性阻滞是必要的，而该阻滞又会导致肿瘤细胞完全的生长抑制。Gardner等［５］在研究中发现缺氧可诱导P27的产生，抑制CDK２的活性，从而阻滞细胞周期，如减少或清除P27将消除缺氧所致的G１期阻滞。Polyak等［１，６~８］研究发现在TGF-β、接触抑制及外源性细胞生长抑制因子处理的细胞系中，P27蛋白的表达增加，但处理前后细胞内P27蛋白的ｍＲＮＡ无明显变化。一方面，TGF-β通过抑制CDK4的合成，使得与cyclinＤ-ＣＤＫ结合的P27量减少，从而相对增加与ｃｙｃｌｉｎＥ-ＣＤＫ２结合的量；另一方面，TGF-β还可通过提高CDK４、ＣＤＫ６特异性抑制剂P１５的表达量，P１５与ｃｙｃｌｉｎＤ-ＣＤＫ４的结合释放出与cycｌｉｎＤ-ＣＤＫ４结合的P27，使其游离量上升，足以抑制cyclinE-ＣＤＫ２，使细胞周期停滞于G１相。Kato等［９］发现经过cAMP处理的巨噬细胞，细胞内P27蛋白的合成明显增加。Rivard等［１０］发现以P27ｃＤＮＡ的反义核酸转染生长静止的细胞，P27蛋白合成减少，P27蛋白的缺少使细胞自动进入细胞周期。以上说明细胞外信号可以通过调节P２７活性来进一步调控细胞周期。

    ３P27与胃癌的关系

    P27作为细胞周期的负性调控因子，被认为是一种抑癌基因。但是，就目前已有的研究结果却发现P27基因的缺失、突变与重排在人类肿瘤细胞中是罕见现象。因此P27与肿瘤关系的研究重点放在其蛋白水平改变上。维持胃粘膜上皮细胞增殖与凋亡的平衡依靠P27蛋白的适度表达，当其表达降低或缺失时，则出现胃粘膜上皮细胞增殖失控，凋亡抑制，引起胃癌的发生。

    3.1P27蛋白与胃癌的发生、发展胃粘膜癌前病变与P２７蛋白表达降低有关，在正常胃粘膜-肠上皮化生-不典型增生-早期胃癌-进展期胃癌的发展模式中，P２７蛋白表达水平逐渐降低。Shin［11］等研究发现胃癌癌旁组织的P２７蛋白表达水平介于癌组织与正常组织之间，癌组织中P２７蛋白表达水平显著低于正常组织。在进展期胃癌中P２７蛋白的低表达与肿瘤的大小、组织病理学分级、浸润深度、淋巴结转移、临床分期、肿瘤复发及预后显著相关［１２］。Mｏｒｉ 等研究发现P２７高表达组肿瘤较小、侵袭在浆膜内，而P２７低表达组则相反［１３］。Yasui等［１４］研究发现P２７蛋白高表达者，其胃癌恶性程度低、淋巴结转移较少，且在转移灶中P２７表达显著低于原发癌灶中P２７蛋白的表达，结果提示P２７低表达的肿瘤细胞选择性转移到淋巴结或远处器官。Sakakura等［１５］筛测了21168种基因在原发胃癌细胞株(SUN-１）和胃癌腹膜转移恶性腹水胃癌细胞株(SUN-５、ＳＵＮ-１６、SUN-６２０）中的表达，发现P２７蛋白表达水平显著降低，且用Northern blot方法观测到上述细胞株中P２７蛋白表达低下者具有明显的腹膜转移倾向。Mori等［１６］分析了138例原发胃癌病人中P２７的表达情况，其中P２７低表达占62%，P２７高表达占38%。P２７低表达组5年生存率为18%，P２７高表达组5年生存率为59%。显示P２７在胃癌是一个独立的预后因素。

    ３．２P27与基因治疗鉴于P２７蛋白低表达与胃癌的相关性，国外很多学者已经着手开始研究将P２７基因作为肿瘤基因治疗的靶基因应用于肿瘤的治疗中。腺病毒介导的P２７过表达在多种肿瘤系与体外移植肿瘤中都可诱发生长抑制与凋亡［１７］。Ｐａｔｅｌ等［１８］发现将表达P２７-ｐ１６融合蛋白的腺病毒转染肿瘤细胞，引起明显的细胞凋亡，而转染正常细胞则不明显，而且它抗肿瘤的效应显著低于P２７或P１６。Graig已在实验中成功的将腺病毒载体P２７导入MDA-ＭＢ-２３１和MCF-７细胞株中，发现P２７蛋白表达明显增高，明显抑制肿瘤细胞生长［１９］。Li等［２０］研究发现，胃癌细胞系经COX-２选择性抑制剂尼美舒利处理后，出现明显的细胞周期抑制与细胞凋亡，同时伴有P２７蛋白水平升高，由此可看出COX-２选择性抑制剂尼美舒利可能通过上调ｐ２７基因的表达来实现抗肿瘤作用。以上表明ｐ２７基因可作为目的基因用于胃癌的基因治疗。４P２７的展望P２７作为非特异性细胞周期素激酶抑制剂，作为细胞外刺激信号的潜在媒介，参与细胞周期增殖与分化的调控。且P２７蛋白低表达与胃癌发生、发展、恶性程度、侵袭性、浸润深度、淋巴结转移等显著相关，是胃癌的独立预后指标。然而P２７基因及蛋白除具有目前已知的作用外，它是否还有其他生物作用?它又是通过何种途径发挥其生物学作用?各途径间的相互关系如何?P２7在胃癌发生发展过程中是如何作用的?胃癌中P２７失活机制如何?以上问题的解决，将使P２７的作用机制及失活机制更加明了，从而使人工调节P２７表达水平及外部干涉P２７作用通路成为可能。这将为胃癌的基因治疗特别是联合多项基因治疗提供广阔的前景。

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