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【关键词】复方氨基酸注射液;动态比浊法;细菌内毒素;干扰试验;鲎试剂
1材料与方法
1.1材料与试剂细菌内毒素检查用水(BET水)(批号030510,规格10 ml/支,厦门鲎试剂厂);鲎试剂(动态浊度法鲎试仪专用,批号030725,规格0.15 ml/支,厦门鲎试剂厂);细菌内毒素工作品(批号030610,规格10EU/支,厦门鲎试剂厂);复方氨基酸注射(3AA)批号200304012,200304121,200305093,200305161,200306222,规格250ml/瓶,湖北峰江);BET- 32型细菌内毒素测定仪(天津大学无线电厂);ZH- 2自动漩涡混合器(天津药典标准仪器厂);实验所用玻璃器皿经铬酸洗液处理后,再经250℃干烤1h以上,除去外源性内毒素。
1.2方法与结果
1.2.1实验条件:检测温度为37℃;检测波长为660 nm;最长检测时间为8400 s;
1.2.2细菌内毒素限值(L)的确定[1]:按公式L=K/M,K为静脉注射给药的细菌内毒素阈剂量=5.0 EU·ml-1,M为病人每千克体重每小时最大给药剂量。本文采用家兔热原剂量M=10 ml·kg-1·h-1,则复方氨基酸注射液(3AA)细菌内毒素限值(L)为0.5 EU·ml-1。
1.2.3标准曲线制备及可靠性:取细菌内毒素工作品1支加BET水1.0 ml,用封口膜封口,置漩涡混合器上混合15 min,进行10倍稀释,然后2倍稀释,且各步置漩涡混合器上混合30 s,使其最终内毒素浓度为1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156EU·ml-1稀释系列,各取0.15 ml分别加到预先加有0.15 ml鲎试剂的反应管内,混合均匀,插入浊度仪进行检测,每一浓度平行3管,同时用BET水做2管阴性对照(NC),结果见表1。
表1标准曲线的可靠性内毒素浓度EU/ml〖略〗
1.2.4供试品溶液配制及干扰试验:①供试品最大有效稀释倍数(MVD)计算:按公式MVD=L×C/λ,L为复方氨基酸注射液(3AA)的内毒素限值0.5 EU·ml-1,λ为标准曲线最低浓度0.0156 EU·ml-1,C为供试液浓度,当L以EU·ml-1得样品试验时最大有效稀释倍数(MVD)为32倍。②干扰预试验:将3批复方氨基酸注射液(3AA)用BET水稀释为2、4、6、8倍溶液,每个浓度分别取0.15 ml加0.15 ml鲎试剂作为样品检查(Et):同时另取5管,进行同样倍数稀释,并在各浓度溶液中强化0.125 EU·ml-1的内毒素作为样品阳性对照液(Es),分别取上述各液0.15 ml加入预先加有0.15 ml鲎试剂的反应管内进行检测,每个浓度重复3管,并设阴性对照,分别测定各浓度样品液及阳性样品的内毒素含量Et和Es,按下式计算回收率(R)。R(Es-Et)/0.125×100%,结果见表2。
表2供试品干扰预实验样品批号〖略〗
3讨论
实验结果表明:各倍稀释液对鲎试剂不存在干扰作用,4倍可以得到很好的回收率,且动态浊度法进行细菌内毒素定量检测,使用计算机全过程监控,样品反映情况能在显示屏上直观地反映出来,与传统的家兔法相比,避免了动物个体差异及人为判断误差所造成的假阳性或假阴性结果,具有灵敏、简便、结果准确等优点,其检测结果与家兔热原检查结果一致。因此,用动态浊度法检测复方氨基酸注射液(3AA)中细菌内毒素含量是可行的。
参考文献
1. 夏振民.药品细菌内毒素检查的限值[J].药物分析杂志.1995,15(3):54
2. 中国药典.二部[S].2000附录 204
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