脐带血用于血友病A产前诊断的研究

　　【摘要】  目的  探讨应用脐带血对血友病A（HA）进行产前诊断的可行性及准确性。方法  24例HA携带者妊娠20～２４周时在超声引导下抽取脐血，用一期法检测孕妇外周血及胎儿脐血FVⅢ：Ｃ，用ELISA方法检测FVⅢ：ＣＡｇ及ｖＷＦ；应用LDＰＣＲ技术对携带者及其胎儿进行内含子22倒位检测，对非倒位者应用Bｃ１　Ⅰ PCR／ＲＦＬＰ分析技术进行间接基因诊断。结果  24例携带者血浆FVⅢ：Ｃ，ＦＶⅢ：ＣＡｇ及ｖＷＦ分别为36％～１５０％(平均79%±２２％)，90%～１３２％(平均102%±１８％），92％～１４１％(平均107%±１６％）；２４例胎儿血浆FVⅢ：Ｃ，ＦＶⅢ：ＣＡｇ及ｖＷＦ分别为09％～９０％(平均417%±２５％），６０％～７７％（平均69%±１６％），５８％～７４％（平均66%±１３％），19例胎儿FVⅢ：Ｃ高于34%，5例胎儿FVⅢ：Ｃ低于5%；内含子22倒位胎儿1例，倒位携带者3例；Bc1 Ⅰ　ＰＣＲ／ＲＦＬＰ连锁分析诊断中型HA胎儿2例。结论  脐静脉穿刺取血测定FVⅢ：Ｃ是产前诊断HA的可行性手段，应用LDＰＣＲ和Bcl Ⅰ　ＰＣＲ／ＲＦＬＰ基因分析技术可提高HA携带者的诊断率。

　　【关键词】  血友病A；产前诊断；脐带穿刺
　　
　　Prenatal diagnosis in hemophilia A by fetal blood sampling

　　ＺＨＡＮＧ Xueqin ＣＨＥＮ Huichang  ＬＩ　Ｗenchao   et al

　　Ｓhandong Blood Center Shandong Center of Hemophilia Diagnosis and Treatment,Jinan 250014

　　【Ａbstract】  Objective  Ｔo investigate the feasibility and accuracy of hemophilia A prenatal diagnosis by fetal blood sampling.Ｍethods  Ｃordocentesis were performed in 24 pregnant hemophilia A carriers during 20~２４　ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ　ｗｅｅｋｓ．Ｔｈｅ　ｐｌａｓｍａ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　Ⅷ activity (FVⅢ：Ｃ） of carrier's peripheral blood and fetus umbilical blood were detected by Bigg's onestage.Ｍethod  The concentration of von Willbrand Factor (vWF) and FVⅢ：CAｇ　were assayed by ELISA.Intron 22 inversion was directly examined by long distance polymerase chain reaction,indirectly gene diagnosis was done by utilizing heredity linkage analysis of factor Ⅷ　ｉｎｔｒａｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　（ＲＦＬＰ）　ｏｆ　Ｂｃｌ　Ⅰ．Ｒesults  ＦＶⅢ：Ｃ，ＦＶⅢ：ＣＡｇ　ａｎｄ　ｖＷＦ　ｏｆ　２４　ｃａｒｒｉｅｒｓ　ｗｅｒｅ　　３６％～１５０％，９０％～132%　ａｎｄ　９２％～１４１％，respectively.The average were 79%±２２％，102%±１８％ 　ａｎｄ　１０７％±１６％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＦＶⅢ：Ｃ，ＦＶⅢ：ＣＡｇ　ａｎｄ　ｖＷＦ　ｏｆ　２４　ｆｅｔｕｅｓｅ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｗｅｒｅ　０９％～９0%，60%～７７％　ａｎｄ　５８％～７４％，respectively.The average were 41７％±２５％，６９％±１６％　ａｎｄ　６６％±１３％，respectively.19 cases of 24 fetuses FVⅢ：Ｃ　were higher than 34%,and 5 fetuses were below 5%.LDＰＲＣ showed that 1 fetus and 3 carriers were FVⅢ ⅣＳ２２，　ａｎｄ　２　ｆｅｔｕｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉａｇｎｏｓｅｄ　ＨＡ　ｂｙ　Ｂｃｌ　Ⅰ　ＰＣＲ／ＲＦＬＰ．Ｃonclusion  Ｉt is an effective method in prenatal diagnosis of hemophilia A to detect FVⅢ：Ｃ of fetuses umbilical blood.The technology of LDＰＣＲ and Bcl Ⅰ PCR/RFLP can improve the detection of hemophilia A carrier.

　　【Ｋey words】  hemophilia A，prenatal diagnosis，cordocentesis

    血友病A(HA)是一种最常见的X连锁隐性遗传性出血性疾病，其病因是由于凝血因子Ⅷ基因缺陷所致的凝血因子量的缺乏或质的异常，在男性中发病率为1／５ ０００［１］。患者需终生输注凝血因子Ⅷ(FVⅢ）制剂治疗和预防出血，给社会和家庭带来沉重的经济负担。由于目前缺乏对此病的根治措施，故致病基因携带者检测与产前诊断，是降低发病率、提高人口质素质的有效手段。通过产前诊断的方法，可以避免HA患儿或携带者出生，达到从源头上控制HA的目的。近年来，我们和山东省立医院妇产科合作应用脐带穿刺术抽取脐血对24名血友病A携带者进行了产前诊断，取得了较好的效果，现报告如下。

　　１  临床资料

　　１．１  一般资料  24例HA携带者来自河北、山东、河南等省的16个HA家系，经遗传学分析肯定携带者11人，可能携带者13人，家族先证者由本中心及其他省级医院按HA诊断标准进行确诊［2］，其中重型HA家系7例，中型9例。

　　１．２  血样采集  HA携带者妊娠20～２４周时，用PTC穿刺针在带穿刺支架超声探头引导下经孕妇腹壁抽取胎儿脐血18　ｍｌ，加入含38％枸缘酸钠02　ｍｌ的离心管内，充分混匀，2 400　ｒ／ｍｉｎ离心20 min，取上层2／３血浆供FVⅢ：C、ＦＶⅢ：ＣＡｇ和ｖＷＦ检测，用白细胞层抽取DNA供基因诊断，同时抽取孕妇和丈夫的外周静脉血按上述方法收集血浆和抽取DNA。

　　１．3  实验方法

　　１．３．１  主要仪器：德国BE公司THROMBOTIMER半自动血凝仪，瑞士产FAME全自动酶免分析仪，美国Perkin Elmer公司的PE2400　ＰＣＲ扩增仪，美国贝克曼低温高速离心机，美国ALT超4型B超诊断仪，日本产经皮经肝胆管造影用B型穿刺针(简称PTC针)。

　　１．３．２  主要方法和试剂：用国际通用的一期法检测血浆FVⅢ：Ｃ，试剂盒购自美国太平洋公司和爱尔兰Trinity Biotech公司，质控血浆购自中国生物药品研究所；用ELISA方法检测FVⅢ：ＣAｇ和vWF，试剂盒来自上海太阳生物技术公司；DNA提取试剂盒为美国G＆Ｔ公司生产；长距离聚合酶链反应(long distance polymerase chain reaction,LDＰＣＲ)引物及Tap酶购自北京朝阳医院。其他PCR反应用Taq酶是上海生工产品，二甲亚砜和琼脂糖购自美国Sigma公司。

　　１．３．３  样品DNA提取方法：家系成员采集外周血，产前诊断孕妇在怀孕20～２４周时在B超指引下经孕妇腹壁抽取胎儿脐血，严格按试剂盒操作说明提取DNA。

　　１．３．４  ＰＣＲ扩增：选用PE2400扩增仪。LDＰＣＲ反应体系为25　μｌ，在02 ｍｌ薄壁反应管中加入PCR混合物，混匀后加石蜡油20　μｌ。条件如下：94℃预变性2 min，进入下列循环：94℃变性12 s，65℃复性和延伸15 min，共30个循环，在后20个循环中，每一个循环在65℃的保温时间延长20 s，最后一次72℃延伸8 min。Bc1 ⅠPCR／ＲＦＬＰ分析技术：PCR反应体系为25　μｌ，在02　ｍｌ薄壁反应管中加入PCR混合物，混匀后加石蜡油20　μｌ。PCR反应条件：94℃预变性2　ｍｉｎ，进入下列循环：94℃ ４０ ｓ、50℃ ４０ ｓ、７２℃ ４０ ｓ共35个循环，72℃5ｍｉｎ后进入4℃保温，检测PCR反应产物满意后，取10　μｌ扩增产物，加入1　μｌ　Ｂｃｌ　Ⅰ酶，9　μｌ酶解反应缓冲液，离心混匀，于金属浴中50℃进行酶切3～４　ｈ。

　　１．３．５  结果分析：LDＰＣＲ产物用1×ＴＢＥ缓冲液配制06%琼脂糖凝胶，取10　μｌ　ＰＣＲ产物加33　μｌ　６×上样缓冲液和67　μｌ 1×ＴＢＥ缓冲液，混匀后于37℃水浴10 min，加样品，50伏电压，电泳14～１６　ｈ。EB染色1 h以上，在凝胶成像仪上观察电泳结果；Bcl I PCR/RFLP分析取酶切产物5　μｌ，加入1　μｌ上样缓冲液，用05　Ｘ ＴＢE缓冲液配制2%琼脂糖凝胶，以05ＸＴＢＥ为电泳缓冲液，100V电压，电泳25　ｍｉｎ。在凝胶成像仪上观察电泳结果，进行连锁分析。

　　２  结果

　　２．１  24例携带者外周血血浆FVⅢ：Ｃ为36%~15%，平均79%±22%，11例肯定携带者中低于50%者3例；24例胎儿脐血血浆FVⅢ：Ｃ为09%~105%，平均417%±25%，其中19例高于34%，另外5例胎儿FVⅢ：C分别为09%，10%，24%，28%和4１％。携带者及胎儿血浆FVⅢ：Ｃ，ＦＶⅢ：ＣＡg，ｖＷＦ的浓度见表1。表1  携带者及胎儿血浆FVⅢ：（略）

　　２．２  应用LDＰＣＲ技术对重型HA家系携带者及其胎儿直接进行内含子22倒位检测。正常人DNA经LDＰＣＲ后，从引物P、Ｑ处可以扩增出单一的12 ｋb条带，HA患者FVⅢ基因若发生内含子22倒位，LDＰＣＲ产物为11 ｋｂ，而其家系女性携带者的LDＰＣＲ产物为12　ｋｂ及11 ｋｂ。ＬＤＰＣＲ显示7个重型HA家系中3个家系存在FVⅢ内含子22倒位，1例胎儿为倒位HA患者，其血浆FVⅢ：Ｃ为0９％。

　　２．３  13例非倒位HA家系应用Bcl Ⅰ位点多态性进行基因连锁分析，对6例家系做出诊断，间接基因诊断中型HA胎儿2名，FVⅢ：Ｃ分别为24%和41%。　

　　3  讨论

　　HA致病基因携带者的产前诊断可以避免血友病患儿出生，降低血友病的发病率，提高人口素质，有重大的社会意义和经济效益。以往采用在妊娠18～２１周时，通过胎儿镜取胎儿脐血检测其FVⅢ：Ｃ及ｖＷＦ水平进行产前诊断，该方法的流产、早产儿丢失率为2%～５％［３］，故90年代中期，胎儿镜已很少应用。1983年Daffos等［４］首先报道在超声引导下经皮脐静脉穿刺取血技术，随后这一技术广泛应用于遗传性疾病的产前诊断。此技术具有快速、准确、安全的优点，手术并发症低于绒毛及胎儿镜取样［５］。本研究中我们对24例HA携带者于妊娠20～２４周时抽取脐血进行产前诊断，1次穿刺成功23例，2次成功1例，无1例出现流产、羊水感染或胎死宫内等并发症。检测24例胎儿血浆FVⅢ：Ｃ，１９例高于34%，根据其家族先证者FVⅢ：Ｃ水平判断这19例胎儿为正常胎儿，建议继续妊娠。胎儿出生后随访1年并检测其FVⅢ：Ｃ、ｖＷＦ及FVⅢ：ＣＡｇ，结果均正常，与产前诊断一致，产前诊断准确率达100%；另外5例FVⅢ：Ｃ低于5%的胎儿，结合先证者FVⅢ：Ｃ水平，判断为HA患儿，建议终止妊娠。通过检测脐血中FVⅢ：Ｃ、ｖＷＦ和FVⅢ：ＣＡｇ，可快速、准确的对HA胎儿做出诊断，及时终止妊娠，有效降低HA患儿出生率。HA携带者诊断及产前诊断以往是通过FVⅢ：Ｃ和FVⅢ：ＣＡｇ比值，结合遗传概率进行推算。由于该二项指标在正常人群中的分布范围较大，干扰因素较多，因此仅70%～８０％的待检者得到明确诊断［６］。我们检测的11例肯定携带者中FVⅢ：Ｃ低于50%者仅3例。利用分子生物学技术进行血友病女性携带者及产前诊断，可使诊断准确性大大提高［７］。

　　FVⅢ基因位于Xq28，长达186　ｋB，包括26个外显子和25个内含子，编码长约9　ｋB的ｍＲＮＡ。FVⅢ基因结构庞大，基因缺陷复杂多变，迄今已报道的突变类型有300多种点突变，50余种小缺失，10种插入，80多种大的缺失及很长的基因倒位等。国内外等的资料均证实，约近一半的重型HA患者有FVⅢ基因内含子22倒位［８，９］，因此携带者或产前诊断应首先进行内含子22的倒位的检测。应用LDＰＣＲ技术检测FVⅢ基因内含子22倒位是直接检测HA基因缺陷，若胎儿检测结果阳性即可诊断为血友病A患者。这对一些家系成员不全或由于新生突变所致的HA家系尤其重要［１０］。我们应用LDＰＣＲ技术对7个重型HA家系直接进行内含子22倒位检测，3个家系得到诊断，检出FVⅢ基因内含子22倒位胎儿1例，携带者3例，诊断率达44%，与刘敬忠等报道一致［９］。对于不存在内含子22倒位的家系进行携带者或产前诊断，则采用间接基因诊断的方法，利用基因多态性进行家系成员基因连锁分析，包括PCR／Ｂc1 Ⅰ酶切片段长度多态性，PCR／重复串联数目可变多态性及PCR／二核苷酸序列重复数目多态性技术。我们应用Bc1　ⅠPCR／ＲＥＬＰ分析技术对13例非倒位家系进行连锁基因分析，有6例家系做出诊断，间接基因诊断中型HA胎儿2名，诊断率462%，与Gitschier［８］等报道相一致。联合运用LDＰＣＲ技术，Bcl I　RFLP分析St14VNTR以及二核苷酸重复序列多态性分析技术，几乎可以为所有有家族史的HA家系及携带者做出诊断［７，１１］。

　　产前诊断虽有较高的技术要求与一定的风险，但是通过产前诊断，可阻断HA致病基因的继续遗传，减少HA的发生率，对提高人口素质与社会稳定有极为重要的意义，应在我国普遍推广。

　　参  考  文  献

　　１．　Gitschier J .Genetic mapping and diagnosis of hemophilia A achieved through a Bcl Ⅰ polymerase in the factor Ⅷ gene［Ｊ］.Nature,1985,314:738　

　　２．　张之南．血液病诊断与疗效标准［Ｍ］．北京：科学技术出版社，1998．３０４

　　３．　Elias S,Simpson JL,Hoibrook KA.New York:Churchill Livingstone,1993.77~９０

　　４．　Ｄaffos F,Capella.PM,Forestier F.A new procedure for fetal blood sampling in utero:preliminary results of fiftythree cases［J］.Am J Obstet Gynecol,1983,146:985

　　５．　Ｐielet BW,Socol ML,MacGregor S,et al.Cordocentesis:an appraisal of risks［J］.Am J Obstet Gynecol,1988，１５９：１４９７

　　６．　王振义，李家增，阮长耿．血栓与止血基础理论与临床［M］．第2版.上海：上海科学技术出版社，１９９６.２８３

　　７．　刘敬忠，梁燕，朱春江，等．联合运用四种技术进行血友病A的基因诊断［Ｊ］．中华医学杂志，2001，12：722

　　８．　陈云第，王寅文，吴竟生，等．因子Ⅷ倒位的检测与血友病甲的分子诊断［Ｊ］．中华血液学杂志，1995，16：451

　　９．　Ｌakch D,Kazazion HH,Antonarakis SE,et al．inversions disrupting the factor Ⅷ gene are a common cause of severe hemophilia A［Ｊ］．Nat Genet,1993,5:236

　　１０．　Gitscher,Drayna D,Tuddenham EGD,et al.Genetic mapping and diagnosis of hemophilia  A achieved through a BCL I polymophism in the factor Ⅷ gene［Ｊ］.Nature，1985，738

　　１１．　　Oranwiroon S,AKKarapatumwong V,Amritt P,et al.Determination of hemophilia A carrier by mutation analysis［Ｊ］.Haemophilia,2001,7：２０

　　1 山东省血液中心 山东省血友病诊疗中心  济南市  250014；

　　2 诸诚市人民医院

　　（收稿日期：2005０５２７）