半叶马尾藻多糖对HL60细胞CD11b和CD11a表达的体外影响

　　【摘要】  目的  探讨半叶马尾藻多糖对HL60细胞CD11b、CD11a表达的影响。方法   MTT研究半叶马尾藻多糖对HL60细胞体外增殖的影响，采用流式细胞术研究对CD11b、CD11a表达的影响。结果  半叶马尾藻多糖能增高CD11b、CD11a的表达率，且作用随时间和浓度的增加而增强。结论  半叶马尾藻多糖在体外可影响HL60细胞CD11b、CD11a的表达，提示其在抗肿瘤方面有一定的开发应用前景。

　　【关键词】   半叶马尾藻多糖；HL60细胞；CD11b；CD11a

　　Effects of  seaweed polysaccharide from Sargassum confusum on the expression of CD11b and CD11a in  HL60 cell

　　TANG Shenhua  JIA Xiuhong  ZHU Shuxia  et al

　　Department of Pediatrics ,Binzhou Medical College,Binzhou  256603

　　【Abstract】  Objective  To explore the effect of seaweed polysaccharide from Sargassum confusum on the expression of CD11band  CD11a  in  HL60 cell. Method  The MTT and FCM approaches were adopted.Result  Seaweed polysaccharide can increase the expression of CD11b and CD11a in a doseand timedependent manner.Conslusion  The seaweed polysaccharide can interfere with effect the expression of CD11b and CD11a in HL60 cell，suggesting  it can be used as an antileukemia drug.

　　【Key words】  SP，Hl60 cell，CD11b，CD11a   

　　多糖在细胞的生命活动中起着重要作用，它参与了细胞的生长、分化、衰老和死亡过程。我国传统中医常用马尾藻等治疗乳腺癌与子宫癌，国外也开展了使用海藻多糖进行肿瘤防治的研究。本文采用由湛江产半叶马尾藻中提取的半叶马尾藻多糖（seaweed polysaccharide from Sargassum confusum,SP）研究其对HL60细胞CD11b、CD11a表达的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  药物与试剂  SP（广东医学院刘秋英硕士惠赠），RPMI1640培养基（Gibco Co,USA）， FITC 标记的鼠抗人CD11a 单克隆抗体 （Exalpha Biologicals Inc,USA），FITC标记的鼠抗人CD11b单克隆抗体（Exalpha Biologicals Inc,USA），FITC标记的非特异鼠抗人IgG2a（Exalpha Biologicals Inc,USA）。

　　1.2  主要仪器  OLYMPUS IMTI型倒置相差显微镜（Japan），EPICSXL流式细胞仪（Coulter Co,USA），丹尼酶标仪（MK3）(Denmark)，SWCJIFD 医用净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司），SHZLAB培养箱（USA）。

　　1.3 方法

　　1.3.1  细胞培养：HL60细胞株由广东医学院生化教研室提供。采用含10%新生牛血清终浓度为100 U/ml青霉素、链霉素的RPMI 1640液体培养体系，置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，隔天换液一次。实验选用对数生长期细胞。

　　1.3.2  MTT抑制实验：参照文献［1，2］，将细胞以2×105/ml密度接种于96孔培养板中，加入不同浓度的SP，置37℃、5%CO2孵箱中分别培养24、48、72 h后，每孔加入MTT（5mg/ml）20 μl,继续培养4 h，加入MTT裂解液（20% SDS +50%DMF+30%H2O）100 μl，37℃、5%CO2孵箱中孵育8h，酶标仪检测各组细胞的A630/A570值，计算抑制率(IR)。 抑制率（IR）＝（1－用药组A值/对照组A值）×100%。

　　1.3.3  FCM检测CD11b、CD11a的表达：取药物处理后的细胞悬液1000 r/min 离心5 min，PBS洗涤2次，并用PBS重悬细胞，调整细胞数为1×106 /ml，取100 μl 细胞悬液，加入10 μl CD11b单克隆抗体和10 μl CD11a 单克隆抗体；另取100μl 细胞悬液，加入10μl IgG2a作阴性对照，4℃避光孵育30 min，PBS洗涤2次，200目尼龙网过滤，上机检测。

　　1.3.4  统计处理：实验数据用x ±s表示，使用SPSS 11.5统计软件进行统计描述，采用单因素方差分析（OneWay ANOVA）。

　　2  结果

　　2.1  MTT结果  以不同浓度（0、50、100、200、400、800 μg/ml）的SP作用于HL60 细胞24、48、72 h，用MTT法检测其对HL60细胞增殖的影响，如表1，图1、2所示，随着SP浓度的增加和作用时间的延长，抑制率逐渐增加。当浓度为800 μg/ml，作用48 h时抑制率为（5130±310）%，与对照组相比差异有显著性（P<001）。其24、48、72 h的IC50为（77678±2830）μg/ml、（50897±2208）μg/ml、（35567±1023）μg/ml。

　　表1  SP对HL60细胞增殖的抑制作用（略）

　　注：与0 μg/ml组相比◇ P<005，◆ P<001； *F =156214，**F =47032, ***F =109831

　　图1  抑制作用的剂效曲线（略）

　　图2  抑制作用的时效曲线(略)  

　　2.2  CD11b、CD11a的表达  结果如表2、3所示，随着药物浓度及作用时间的增加，CD11a、CD11b表达逐渐上升。

　　表2  SP对HL60细胞CD11a表达的影响（略）

　　注：与0 μg/ml组相比△P<005，◆P<001；与300 μg/ml组相比▲P<001，与500 μg/ml组相比★P<001

　　表3  SP对HL60细胞CD11b表达的影响（略）

　　注：与0 μg/ml组相比◇P<005，◆P<001；*F =21533，**F =26044， ***F=36607

　　3  讨论

　　白血病是人群发病率较高的恶性肿瘤之一，化疗是重要的治疗手段，但其副作用是几乎不可克服的缺点。在祖国医学中，中草药在抗肿瘤中的应用源远流长，如马尾藻等治疗乳腺癌和子宫癌。现代研究证明近100种中药多糖具有不同程度的抗肿瘤作用。我们的研究结果表明，SP对HL60细胞增殖呈明显抑制作用，且随药物浓度的提高和作用时间的延长而增强，浓度为100 μg/ml作用24 h即可见对HL60细胞的增殖抑制, 当浓度为800 μg/ml、作用48h时抑制率为（5130±310）%，与低浓度组相比差异有显著性（P<001）。

　　急性白血病是造血干细胞或祖细胞恶性转化引起的疾病，其特点之一是细胞分化阻滞在幼稚阶段，不能形成有正常功能的细胞。随着抗癌机制研究的进展，诱导肿瘤细胞分化已经成为白血病药物治疗的新策略。据报道CD11b在原始粒细胞上基本不表达，随着细胞逐渐向成熟方向分化，CD11b表达逐渐升高，因此CD11b的表达增高被认为是粒细胞分化的标志［3］。本研究结果显示,经SP处理的细胞CD11b表达升高，且随浓度与时间的增加作用逐渐增强，以800 μg/ml处理5 d时作用最强。提示SP可诱导HL60细胞分化。
 
　　粘附分子与恶性肿瘤的关系是近几年来的研究热点,已有资料证实,肿瘤细胞表面多种粘附分子表达异常，与疾病发生、发展及预后密切相关［4，5］。文献报道,急性白血病细胞CD11a 的表达存在明显异质性,可能是导致造血调控网络紊乱的一个原因,与白血病细胞的异常增殖、分化和迁移有关,影响疾病的发生及预后［6~8］。研究表明白血病细胞表面CD11a表达的降低，有利于白血病细胞脱离骨髓基质的正常调控， 从而形成恶性细胞克隆并大量增殖； 同时CD11a表达降低可导致白血病细胞与骨髓微环境成分粘附力下降,从而使白血病细胞更易从骨髓中释出、播散［4，9］ 。此外，Brouwer 等［5］ 研究细胞毒T 细胞(CTL)识别白血病细胞时发现:白血病细胞表达粘附分子CD11a、CD54 及刺激因子降低,使其难以被CTL识别杀伤， 出现“免疫逃脱现象” 。在机体正常免疫监视机制中，CD11a (LFA1) / CD54 ( ICAM1) 介导的CTL 杀伤作用是机体及时发现、识别并杀伤异常细胞(肿瘤细胞) 的重要途径,而白血病细胞表面CD11a 表达下降使其得以逃脱免疫监视并大量增殖。由此推断,白血病细胞粘附分子的表达异常很可能是白血病重要的发病机制之一。

　　多糖作为一种大分子的生物反应调节剂，因对人体无明显的毒副作用，其抗肿瘤作用正日益受到重视。本研究结果提示SP在抗肿瘤方面有一定的开发应用前景。

　　参考文献

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　　2.Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. Reexamination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill［J］.J Immunol Methods ，1989,119(2):203

　　3.王振义，陈　竺.肿瘤的诱导分化和凋亡疗法［M］.上海:上海科学技术出版社,1998.37

　　4.Junichi H , Yoshiko M , Hiroyuki F , et al. Expression of adhesion molecules in childhood B2 lineage cell neoplasms［J］ . Int J Hematol,2000 ,72 :69

　　5.Brouwer RE , Zwinderman KH , Kluinandemans HC ,et al. Expression and induction of costimulatory and adhesion molecules on acute myeloid leukemic cells : implication for adoptive immunotherapy［J］. Exp Hematol ,2000,28 : 161.

　　6. Kawada H, Fukuda R , Yoshida M ,et al. Clinical significance of LEA1 expression in adult acute myeloid leukemia［J］. Leuk Res, 1996,20：327

　　7.刘廷析，刘秀芳，向建平，等. 急性髓系白血病细胞侵袭能力与粘附分子表达关系探讨［J］. 中华血液学杂志,1997,18（1）：29

　　8. Brouwer RE , Hoefnagel J , van Der Burg BB ,et al. Expression of costimulatory and adhesion molecules and chemokineor apoptosis receptors on acute myeloid leukaemia : high CD40 and CD11a expression correlates with poor prognosis［J］. Br J Haematol, 2001, 115：298

　　9.Bradstok M ,Makrynikola V ,Biachi A ,et al. Analysis of  the mechanism of precursor B acute lymphoblastic leukemia cells to bone marrow fibroblasts ［J］. Blood, 1993,82 :3437
  
　　滨州医学院儿科学教研室  滨州市  256603；广东医学院附属医院儿科