点击显示 收起
Protective effects of ischemic preconditioning on ischemia/reperfusion
myocardial injury in hypercholesterolemic rabbits
Luo Yaxiong，Huang Damei
Department of Cardiovascular Disease，Guiyang Medical College，Guiyang550004.
【Abstract】 Objective To investigate the effect of ischemic preconditioning on ischemia/reperfusion myocarˉdial infarct，PMNCD11b/CD18in hypercholesterolemic rabbits.Methods Male rabbits were fed with cholesterol enˉriched diet forfour weeks and then divided randomly into groups（A and B）without and with ischemic preconditionˉing，respectively.A second series of rabbits fed a normal diet were similarly divided into two groups（C and D）without and with preconditioning，respectively.All the animals were subjected to60min myocardium ischemia and120min myˉocardium reperfusion.Preconditioning animals（B and D）underwent twocycles of5min myocardium ischemia and10min myocardium reperfusion before60min myocardium ischemia.The expression of protein PMNCD11b/CD18was determined by immunohistochemistry.Myocardial infarct size（AN）and areas at risk（AAR）were delineated with Eˉvan’s blue and TTC staining.We also measured concentrations of total cholesterol in serum by CHOD-PAP.Results Cholesterol in groups A and B was1.31±0.39mmol/L at baseline and21.52±9.27mmol/L at four weeks（P<0.01）and in groups C and D1.45±0.84mmol/L before the surgical procedure.AN/AAR%was39.16±4.99%in group A，11.02±2.78%in group B（P<0.01），38.00±4.88%in C and11.09±2.98%in D（P<0.01）.The expression of protein PMNCD11b/CD18increased significantly in control groups（A and C）while no difference in isˉchemic preconditioning groups（B and D）except for that enhanced at the time of preischemia.Conclusion Ischemic preconditioning can attenuate ischemia/reperfusion myocardial infarct size and inhibit expression of protein PMˉNCD11b/CD18in hypercholesterolemic rabbits.
Key words preconditioning hypercholesterolemia CD11b/CD18
中性粒细胞（PMN）粘附增强是PMN介导冠脉微循环障碍并导致心肌再灌注损伤的起始环节，抗粘附分子单抗治疗可减轻这种损伤 ［1］ 。缺血预适应（IPC）具有心肌保护效应已在许多正常动物模型中得到证实 ［2～4］ 。然而在高胆固醇血症家兔的心脏是否仍保留有IPC现象尚不清楚。本研究旨在探讨IPC对实验性高胆固醇血症家兔缺血再灌注（I/R）心肌梗死的影响，及是否与抑制中性粒细胞CD11b/CD18受体表达有关。
1 资料和方法
1.1 实验动物 实验用雄性家兔24只，体重2.94±0.44kg，随机分为2组，每组12只，一组给予0.5%高胆固醇饲料饲养4周，给予高胆固醇饲料饲养前后分别从耳缘静脉采血测胆固醇，然后随机分为对照组（A组，n=6）和实验组（B组，n=6）;另一组给予普通饲料，耳缘静脉采血测胆固醇，随机分为对照组（C组，n=6）和实验组（D组，n=6）。
1.2 动物模型制备
3%戊巴比妥钠（1mg/kg）麻醉，机械呼吸，静脉插管，针形电极刺入肢体，接心电图机，必要时记录;胸骨左缘开胸，剪开心包膜，暴露心脏，于LAD近第一分支处穿引3-0号丝线，丝线套一小段橡皮管，将橡皮管两端丝线拉紧固定，即造成冠脉血流中断，供血区心肌颜色由鲜红转为暗紫色，心电图示ST段弓背向上抬高大于0.5mV，证实闭塞有效，放松丝线后，血流再通即再灌注。实验组（B组，D组）依次经历缺血5min，再灌注10min，反复2次，然后缺血60min，再灌注120min;对照组（A组，C组）缺血60min前观察30min，其余程序同实验组。
1.3 胆固醇测定 酶法测定血清总胆固醇，其检测步骤见胆固醇测定试剂盒（温州东瓯生物工程有限公司生产）说明书。
1.4 心肺梗死范围测定 再灌注120min末，即取心脏，原处结扎LAD，经主动脉逆行灌注0.5%Evan’s蓝染色3min，分离左心室并称重;从心尖向心底将左室横切成3～4mm薄片，将蓝染的正常区域和未染色的危险区域心肌分离并称重，将危险区域心肌浸入1%TTC的磷酸盐缓冲液（pH=7.4）中，37℃温浴20min后取出，将不着色的梗死区和染成砖红色的非梗死区心肌分离并称重，计算梗死区域心肌（AN）占危险区域心肌（AAR）重量的百分比和危险区域心肌占左室（LV）重量的百分比，缺血区心肌置-20℃冰箱保存 备用。
1.5 免疫组织化学法测定PMN CD11b/CD18 取2ml肝素抗凝全血分离出中性粒细胞涂片，无水乙醇固定，加鼠抗兔CD11b单克隆抗体37℃孵育30min，PBS洗涤3次，加二抗置30min，PBS洗涤3次，加APAAP复合物静置30min，PBS洗涤3次，加碱性磷酸酶底物显色30min，自来水冲洗终止显色，苏木素复染1min，自来水冲洗，甘油明胶封片;光镜下观察PMN胞膜呈棕红色者为阳性细胞，随机计数100个PMN并计算出阳性细胞数。
1.6 统计学处理 所有数据经SAS6.12软件统计处理;计量资料以均数±标准差（X±s）表示;组间比较用成组t检验，组内比较用配对t检验;P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 血清总胆固醇浓度 高胆固醇饲料组（A、B组）在给予高胆固醇饲料喂养4周前后血清总胆固醇浓度分别为1.31±0.39mmol/L、21.59±9.27mmol/L，两者比较差异具有显著性（P<0.01）;普通饲料组（C、D组）血清总胆固醇浓度为1.45±0.48mmol/L，与高胆固醇饲料组基础值比较差异无显著性。
2.2 心肌梗死范围 IPC组（B、D组）分别与对照组（A、C组）比较，左室重量、危险心肌组织重量和危险心肌组织占左室重量的百分比之间差异无显著性;梗死组织重量和梗死组织占危险心肌组织重量的百分比之间差异有显著性（P<0.01）。A与C、B与D组间，各指标差异均无显著性（P>0.05），见表1。
表1 心肌梗死范围 （X±s）
注:与对照组比较 ˇˇ P<0.01
2.3 缺血预适应不同时间PMN CD11b/CD18蛋白表达的变化 IPC组（B、D组）分别与对照组（A、C组）比较，在心肌缺血前PMN CD11b/CD18蛋白表达上调（P<0.05），在心肌缺血1h和再灌注2h后PNM CD11b/CD18蛋白表达明显下调（P<0.01），在基础时比较差异无显著性;A、C组缺血1h 和再灌注2h PMN CD11b/CD18蛋白表达与同组基础比较显著上调（P<0.01），而缺血前与基础比较差异无显著性;B、D组缺血前PMN CD11b/CD18蛋白表达与同组基础比较上调（P<0.05），而缺血1h和再灌注2h与同组基础比较差异无显著性，见表2。
表2 缺血预适应不同时点PMN CD11b/CD18蛋白表达的变化
注:在不同时点与对照组比较 ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01;与同组基础比较 △ P<0.01
3 讨论
大量动物实验资料证实 ［2～4］ ，IPC具有明显的心脏保护作用，表现为缩小心梗面积，促进心肌功能恢复，减少再灌注心律失常的发生等。在IPC早期保护中，由eNOS产生 的NO能直接开放线粒体膜K