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【摘要】 目的 明确VES对口腔鳞癌细胞Tca8113的作用，为临床应用VES防治口腔鳞癌提供科学的实验数据。方法 RTPCR法检测促凋亡基因bax在mRNA水平上的表达，Western blot检测促凋亡基因bax在蛋白水平上的表达。结果 bax基因在mRNA水平上及蛋白水平上表达上调。结论 VES诱导口腔鳞癌细胞Tca8113的凋亡作用，bax基因可能参与该过程。
【关键词】 VES；口腔鳞癌；bax基因
Bax Gene Expression in oral squamous cell carcinomas Tca8113
SONG Xiaodong ZHAO Dongmei YANG Junhou et al
College of Basic sciences, Binzhou Medical University,Binzhou 256603
【Abstract】 Objective To probe into vitamin E succinate for selective antitumour activity in oral squamous cell carcinomas. Methods Using RTPCR detected and quantified the expression of bax mRNA. Western blot measured relative amounts of the bax protein.Results Bax mRNA and protein levels upregulated.Conclusion The mechanism of apoptosis is possibly related to the expression of bax.
【Key words】 VES,oral squamous cell carcinomas,bax gene
维生素E琥珀酸酯（vitamin E succinate, VES）因其含有OCO(CH2)2COO基团,在生理酸碱条件下可以带电荷，这个基团在高选择性地诱导肿瘤细胞凋亡的过程中扮演了重要角色［1］，根据众多文献报道［2~4］，VES对前列腺癌、乳腺癌、消化道系统的恶性肿瘤特别是对头颈部肿瘤有明显的抑制作用，其主要作用机制是诱导肿瘤细胞或者刚刚变异的细胞凋亡。本文采用体外培养的口腔鳞癌细胞Tca8113株检测了bax基因在VES诱导的口腔鳞癌细胞凋亡中的表达。
1 材料和方法
1．1 材料 VES购自Sigma 公司，Tca8113细胞株购自中科院上海细胞所，RPMI 1640培养基购自Gibco公司，bax基因引物：5′TGGCGATGAACTGGACAACAAC3′,5′CCCGAAGTAGGAAAGGAGGC3′；actin 基因引物 5′AACCGTGAAAAGATGACCCAG3′, 5′CTCCTGCTTGCTGATCCACAT3′。
1．2 方法
1．2．1 细胞培养 Tca8113细胞接种于细胞培养瓶中，加入含10%小牛血清，100 U/ml青霉素、链霉素的RPMI 1640培养液，培养于37 ℃、5%CO2培养箱中，每3~4 d传代1次。
1．2．2 反转录聚合酶链式反应（RTPCR) ：选取实验组、对照组细胞，加入1 ml RNA exReagent，将细胞并RNA exReagent一起移入Ep管中。室温静置5 min，再加入200 μl氯仿，用力颠倒Ep管混匀。静置5 min后，12 000 r/min 10 min。小心将上层水相移至Ep管中，加入500 μl异丙醇，振荡混匀，室温静置8 min。高速离心5 min，小心弃上清。加入1 ml 75%乙醇，振荡片刻，7 500 r/min 5 min，小心弃上清。室温静置12 min使RNA沉淀恰好干燥，加入水溶解RNA。720分光光度计上测260 nm、280 nm的OD值，计算RNA的浓度。取等量RNA、OligdT、DEPC水共13 μl。70 ℃加热8 min，立即将微量离心管冰浴至少1 min，然后加入下列试剂：5′buffer 5 μl，dNTPs 5 μl，MMLVRT 1 μl，Rasin 1 μl，轻轻混匀，放入37 ℃恒温水浴锅中60 min。90 ℃，2~3 min。50 μl反应体系：灭菌三蒸水34 μl，引物1 1 μl，引物2 1 μl，10′buffer (MgCl2 2.5mmol/L) 5 μl，dNTPs 5 μl，Taq酶 1 μl，cDNA 3 μl，混匀，7 500 r/min 30 s，石蜡油覆盖。PCR循环参数设置：预变性94 ℃ 350 s，变性94 ℃ 60 s，退火60 ℃ 60 s，延伸72 ℃ 60 s，再延伸72℃ 300 s，共35个循环。
1．2．3 Western Blot定量蛋白：收集实验组、对照组细胞裂解，SDS聚丙烯酰胺凝胶加样，当溴酚蓝到达胶底部时停止，把胶放入缓冲液中平衡10 min。转膜后放入5%脱脂奶粉、003%叠氮钠的TBS中平衡1 h。加一抗，摇床上作用8 h。TBST漂洗3次，每次5 min。加二抗，摇床上作用2 h。ECL荧光显影液加膜上1 min，终止反应，暗室内显影，定影。
2 结果
2．1 RTPCR结果 bax 基因经PCR扩增后，15%的琼脂糖凝胶上电泳，在Eagle Eye Ⅱ 凝胶成像分析仪上可以看到图1的条带，为使实验有一定的可比性，设置内参actin，其中对照组亮度明显低于VES作用6、12、24 h的亮度。bax基因与actin基因条带的灰度比值见表1。
图1 bax基因在mRNA水平上的表达随时间的变化图（略）
表1 bax基因和actin基因条带的灰度比值（略）
与对照组相比﹡P＜005
2．2 Western blot结果 随着VES作用于Tca8113细胞时间的延长，bax条带越来越亮。bax蛋白和actin蛋白条带的灰度比值见表2。
表2 bax蛋白和actin蛋白条带的灰度比值（略）
与对照组相比﹡P＜005
3 讨论
1998年美国研究人员Hartman等对维生素E和β胡萝卜素预防肿瘤的研究表明［５］，服用维生素E的受试者中，肿瘤的发病率降低32%，死亡率降低41%，由此维生素E防治肿瘤受到极大的关注。2000年以美国国立肿瘤研究所做了大规模的临床实验［6］，大约有32 000美国男性参与此实验，受试者每日服用200 μg硒和400国际单位的合成维生素E，研究发现维生素E不仅能降低肿瘤的发病率和死亡率，而且对体外培养的肿瘤细胞有较高的细胞毒性。VES是维生素E的酯化衍生物，与维生素E及其衍生物相比，VES的功能有严格的选择性，它能诱导变异细胞和癌细胞凋亡，并能促进正常细胞分化［7~9］。然而VES对口腔鳞癌的抑制作用尚未见报道。结果显示VES能抑制口腔鳞癌细胞生长并诱导细胞凋亡，VES作用于口腔鳞癌细胞3 h后细胞活率显著降低；随着VES作用时间的延长，LDH释放增加，反映了鳞癌细胞膜的受损越来越严重。从流式细胞仪检测结果看到VES引起细胞死亡的方式主要是凋亡，VES作用24 h后凋亡的鳞癌细胞达到最大峰值（结果正在进一步整理中）。本文RTPCR反应是以鳞癌细胞总RNA为模板，依据bax的cDNA设计引物，对其进行mRNA水平上的半定量，并利用Western实验在蛋白水平上也进行了定量，结果显示促凋亡基因bax无论在mRNA水平还是在蛋白水平其表达量在VES作用的24 h内持续增加，提示其持续增加可能导致了鳞癌细胞的凋亡。当然细胞凋亡的发生不仅取决于bax基因，还受到其他基因如bcl2家族的影响，因此VES诱导鳞癌细胞凋亡的机制尚需进一步的研究。
参考文献
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基金资助项目：滨州医学院科技计划项目BY2005KJ02；美国NIH 基金资助 U54 CA91409，P20 CA11877001
滨州医学院基础学院 滨州市 256603；霍华德大学口腔学院肿瘤研究中心