大鼠局灶脑缺血基质金属蛋白酶2的表达

【摘要】  目的 研究大鼠局灶脑缺血后基质金属蛋白酶2（Matrix metalloproteinase2, MMP2）在不同时相的表达，探讨MMP2与缺血性损伤的关系。方法 制作大鼠自体血栓性大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，在不同时点用免疫组化染色观察MMP2表达情况，并与假手术组进行对照。结果 缺血6 h后MMP2表达很少，24 h表达上调，5 d达最高水平。MMP2主要表达在星形细胞、巨噬细胞。结论 缺血后出现MMP2表达的上调，影响缺血性卒中的转归。

【关键词】  大脑中动脉闭塞；免疫组化；缺血性脑损伤

    Matrix metalloproteinase2 expression of rats after transient focal cerebral ischemia

    ZHANG Shuping WANG Guihua WANG Yuanfang et al

    Department of Pharmacology,Binzhou Medical University,Binzhou 256603

    【Abstract】 Objective To explore the induction of matrix metalloproteinase2 expression at different time after transient focal cerebral ischemia in order to understand the relation between MMP2 and tissue injury in ischemic brain. Methods Rats were subjected to embolic focal ischemia by placing homologous blood clots into the middle cerebral artery The expression of matrix metalloproteinase2 of all the groups was analysed by immunohistochemistry at 6 h,1 d,2 d,3 d,4 d,5 d after ischemia and compared with sham operation.Results The expression of MMP2 at 6 h after ischemia was very limited, then significant upregulation at 24h. MMP2 activity reached maximum levels by 5d.The expression of MMP2 was detected in astrocytes and macrophages.Conclusion The study indicated that MMP2 was upregulated，which possibly had affection to the development of stroke.

    【Key words】 cerebral ischemia,matrix metalloproteinases,immunohistochemistry

    缺血性脑损伤的原因之一是局部发生炎症反应，最早是白细胞粘附内皮细胞，继而血脑屏障遭破坏，炎性细胞侵入缺血受伤脑组织。血脑屏障对维持神经组织内环境的相对稳定十分重要，研究发现脑缺血及再灌后出现MMPs的表达增加，尤其是MMP2和MMP9活性增加，与脑微血管通透性、血脑屏障(BBB)通透性、BBB的崩溃、炎性细胞侵入和脑水肿明显相关。使用合成的MMPs抑制剂可以不同程度地抑制以上改变。故本研究以大鼠为对象，研究短暂大脑中动脉闭塞(MCAO)诱导的局灶脑缺血后MMP2不同时相的表达，探讨MMP2在局灶性脑缺血中的作用。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物及分组 由山东医科大学新药评价中心动物部提供的Wistar雄性大鼠42只, 鼠龄2个月左右,体重300~400 g,随机分为7组，每组各6只：①假手术组；②缺血6 h组；③缺血1 d组；④缺血2 d组；⑤缺血3 d组；⑥缺血4 d组；⑧缺血5 d组。

    1.2 主要试剂来源 MMP2单克隆抗体，内源性过氧化物酶阻断剂，生物素标记二抗工作液，辣根酶标记链霉卵白素工作液，正常山羊血清,DAB显色试剂盒，多聚赖氨酸防脱片剂，抗体稀释液, OTC（冰冻切片包埋剂），以上试剂均来自北京中山生物技术有限公司。

    1.3 大鼠自体血栓MCAO的制作 采用毛春等在Busch法［1］基础上引进和改良的方法［2］制作大鼠自体血栓MCAO模型。

    1.4 假手术组的制作 将大鼠用10%水合氯醛麻醉，于颈正中切开皮肤后，逐层分离以暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉和翼腭突动脉，将颈外动脉远心端结扎，结扎翼腭突动脉，颈总动脉和颈内动脉处打活结结扎。然后将颈外动脉远心端剪一“Ｖ”型小口，将含磷酸缓冲液的麻醉导管末端从切口处由颈外动脉远心端向近心端方向逆向穿刺至颈总动脉分叉处。固定麻醉导管，松开颈内动脉处活结，缓缓将导管内磷酸缓冲液注入颈内动脉，结扎颈外动脉近心端，松开颈总动脉活结，逐层缝合浅筋膜和皮肤。

    1.5 标本取材 每组动物分别用10%的水合氯醛麻醉后，立即暴露心脏，经左心室快速灌注PBS（4℃）40 ml后再灌注4%的多聚甲醛（4℃）40 ml, 快速断头取脑后浸入4%的多聚甲醛（4℃）24 h，最后保存在4℃的磷酸缓冲液中20%的蔗糖溶液中。

    1.6 免疫组织化学方法 冰冻切片室温放置30 min后，PBS洗3次，3%过氧化氢孵育，正常山羊血清工作液封闭，滴加1∶20的MMP2单抗孵育过夜，然后逐次滴加生物素标记二抗工作液和辣根酶标记的链霉卵白素工作液，DAB显色，脱水，透明封片。

    2 结果

    MMP2阳性表达细胞数与对照组比较在缺血6 h没有明显差别，在缺血24 h有所增加，到缺血5 d达到最高峰，主要表达在星形细胞、巨噬细胞，免疫阳性细胞呈现棕黄色淡染颗粒（如图1所示）。图1 免疫阳性细胞呈现棕黄色淡染颗粒

    3 讨论

    基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一组含Zn2+的能降解细胞外间质的蛋白酶,通常在中性条件下发挥活性，有Ca2+参与时活性最大。MMPs在基底膜降解中起着主要作用。可以诱导MMP表达的有白介素1(IL1)、IL6、肿瘤坏死因子α(TNFα)、上皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、和转化生长因子β(TGTβ)。MMP的蛋白水解酶活性受非特异性和特异性抑制因子的抑制。非特异性因子包括α2巨球蛋白、α1抗蛋白酶和BB94(Batimistat)，特异性抑制因子为基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitory fmetalloproteinase,TIMP)。微血管的完整性在局灶性缺血时被破坏，其中MMP2和MMP9与脑血管病联系的研究较多。MMP2酶原分子量为72 kD，活性分子量为66 kD；MMP9酶原分子量为92 kD,活性分子量为83 kD。MMP2和MMP9一经合成即以无活性形式从细胞内分泌到细胞外，在体内被特殊的蛋白酶切割而产生活性。MMP2的主要底物包括明胶,胶原 IV、V 、VII、X,层粘连蛋白,弹性蛋白及纤连蛋白；MMP9的主要底物包括明胶，胶原 IV、V，弹性蛋白。研究［3，4］发现MMP9在心脑血管疾病中起重要的作用，它的激活和脑血管关键蛋白成分的降解与出血和水肿的发展相关［5，6］。脑毛细血管壁以 IV型胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白作为基底膜的主要组成成分。局灶性缺血可以引起基底膜通透性和结构的变化,这种变化已经被认为是局灶性缺血所致微血管出血的主要原因。本研究发现MMP2的表达有时间依赖性，MMP2在缺血6 h未见表达增加，24 h出现表达增加，缺血后5 d达高峰，这正是血管生成及神经胶质增生出现的时间，提示MMP2在修复过程中作用轻重，而且有助于血管生成及神经胶质增生。星形细胞主要通过MMP2调节血脑屏障。Heo等［7］对27例清醒状态下灵长类动物MCAO/R的不同时期进行了研究，大脑中动脉阻断后1 h基底神经节的MMP2前体的含量明显增加，并且之后持续升高。MMP2的表达与神经元受损范围和数量高度相关(r=09763，SE=0004，P=00008)。而MMP9活性在同一时期变化较小(P=011),并且与神经受损范围和数量无相关性(r=0.455，SE=0289，P=0033)。而在局部脑缺血所致出血变化发生时,MMP9表达明显升高(P=0.013)，此时MMP2不升高(P=0.57)。这些发现提示了MMP2在降解基底膜致神经原损伤及MMP9在局灶性缺血所致出血变化中的早期潜在作用。Rosenberg等［8］较早发现在大鼠脑内注射MMP2可促使BBB开放。脑缺血后MMP2及MMP9通过蛋白水解作用破坏毛细血管紧密连接和基底膜,继而引起血管源性脑水肿。他们随后的研究又发现持续大脑中动脉闭塞(MCAO)模型大鼠在缺血后24～48 h脑水肿达到高峰,与脑内MMP9活性增高的时间一致。5 d后MMP2活性较对照组才明显增高,推测MMP2可能与损伤后组织修复有关。Anthony等［9］发现ＭＭＰ9在中风一周后病人脑组织的中性粒细胞有强烈表达，而MMP2染色远不如MMP9明显。中风一周后到5年,脑实质中性粒细胞消失,但存在大量表达MMP2的巨噬细胞。说明MMP9与中风急性期BBB及脑组织破坏有关,而MMP2可能在缺血后组织修复、神经再生过程中起作用。以上结果存在部分差异,可能是MMPs的表达依据脑损害的性质和时间长短有个体差异,也可能与实验设计本身有关。但在MMP2、MMP9可降解ECM,改变血管通透性,参与血管源性脑水肿和脑出血机制，影响缺血性卒中的转归和预后方面已有共识。我们期待得到更成熟、一致的结论。

【参考文献】
  ［1］ Busch E,Kruger K,Hossmann KA.Improved model of thrombolic stroke and rtPA induced repefusion in the rat［J］.Brain Research,1997,778:16.

［2］ 毛春，张苏明,邓小红,等.一种改进的自体血血栓栓塞性大鼠缺血性脑卒中模型［J］.中华老年心脑血管疾病杂志,2000,2(1):48.

［3］ Spinale FG. Matrix metalloproteinases: regulation and dysregulation in the failing heart［J］. Circ Res，2002，90: 520530.

［4］ Galis ZS, Khatri JJ. Matrix metalloproteinases in vascular remodeling and atherogenesis: the good, the bad, and the ugly［J］. Circ Res，2002，90: 251262.

［5］ Asahi M, Wang X, Mori T, et al Moskowitz MA, Fini ME, Lo EH. Effects of matrix metalloproteinase 9 gene knockout on the proteolysis of bloodbrain barrier and white matter components after cerebral ischemia［J］.J Neurosci，2001，21: 77247732 .

［6］ Heo JH, Lucero J, Abumiya T,et al.Matrix metalloproteinases increase very early during experimental focal cerebral ischemia［J］. J Cereb Blood Flow Metab，1999，19: 624633.

［7］ Heo JH,Lucero J,Abumiya T,et al.Matrix metalloproteinases increase very early during experimental focal cerebral ischemia［J］.J Cereb Blood Flow Metab,1999,19(6):624633.

［8］ Rosenberg GA,Navratil M,Barone F,et al.Proteolytic cascade enzymes increase in focal cerebral ischemia in rat［J］.J Cereb Blood Flow Metab,1996,16(3)：360366.

［9］ Anthony DC,Ferguson B,Matyzak MK,et al.Differential matrix metalloproteinase expression in cases of multiple sclerosis and stroke［J］.Neuropathod Appl Neurobiol,1997,23(5)：406415.

作者单位：1 滨洲医学院药理学教研室 滨州市 256603；2 烟台海港医院药剂科