MMP2、MMP9及TIMP3在膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义

　　Expressions of MMP2, MMP9 and TIMP3 in human transitional cell carcinoma of bladder and their clinical significance

　　Zhu Honggang, Zhang Jun, Fu Bin, Lang Bin, Xu Kai, Shi Taoping, Chen Jun, Zhang Xu

　　(Department of Urology, Tongji Hosipital, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030,  China)

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the expressions of MMP2, MMP9 and TIMP3 in human transitional cell carcinoma of bladder and discuss their clinical significance. Methods  Using immunohistochemical stains and HMIAS2000 analysis system, the expressions of MMP2, MMP9 and TIMP3 of 35 cases of bladder carcinoma (tumor group) and 10 cases of normal bladder (control group) were analyzed. Results  MMP2 and MMP9 were highly expressed in tumor samples and their expression rates increased with grades and stages. TIMP3 was also highly expressed in tumor samples and its expression rates increased with grades but not with stages. Conclusion  These results suggest that MMP2, MMP9 and TIMP3 play an important role in the invasion step of transitional cell carcinoma of bladder. Detection of their expressions may become a new approach to the diagnosis of urothelial carcinomas.

　　KEY WORDS: MMP2; MMP9; TIMP3; transitional cell carcinoma of bladder

　　摘要：目的  探讨基质金属蛋白酶2，9(MMP2, MMP9)及金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP3)在膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义。方法  采用免疫组化SP法和高清晰度彩色医学图文分析系统对35例膀胱移行细胞癌和10例正常膀胱黏膜中MMP2，MMP9，TIMP3的表达进行检测分析。结果  MMP2，MMP9在膀胱癌中呈高表达，且随分期、分级的增高而增高；TIMP3在膀胱癌中亦呈高表达，且与分级呈正相关，但与分期不相关。结论  MMP2，MMP 9和TIMP3参与膀胱癌侵袭转移，在膀胱移行细胞癌中的表达对其预后判断具有参考价值。

　　关键词：基质金属蛋白酶2；基质金属蛋白酶9；金属蛋白酶组织抑制因子3；膀胱移行细胞癌

　　细胞外基质( extracell matrix, ECM)在肿瘤的浸润与转移过程中起着重要的作用。基底膜( basement membrance, BM)或ECM的降解是肿瘤浸润和转移的前提。基质金属蛋白酶( matrix metalloproteinases, MMPs)通过对ECM的降解而促进癌细胞对周围组织的浸润，是降解ECM诸成分的关键酶\[13\]。金属蛋白酶的组织抑制剂( tissue inhibitors of matrix metalloproteinase, TIMPs)对MMPs有特异性的抑制作用，维持着ECM的降解与合成的平衡，也在肿瘤侵袭转移中起重要作用\[4\]。TIMP3作为TIMPs家族中一个较新的成员，其作用特点在膀胱癌的发病机理中研究的较少。我们应用免疫组织化学方法研究MMP2，MMP9和TIMP3在膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义，报告如下。

　　1  资料与方法

　　1.1  一般资料  2005-2006年间同济医院的膀胱癌手术切除标本35例, 其中男性患者27例，女性8例，患者年龄31-97岁，平均年龄58.4岁。对照组为非膀胱肿瘤手术中切取的正常膀胱组织标本10例。35例均为膀胱移行细胞癌。膀胱癌组织病理分级：G1级12例，G2级13例，G3级10例。TNM国际分期:膀胱移行细胞癌Ⅰ期14例，Ⅱ期12例，Ⅲ期9例。鼠抗人MMP2单克隆抗体、MMP9多克隆抗体、TIMP3多克隆抗体为美国NeoMarkers公司产品，均购自晶美生物工程有限公司；通用型SP二抗试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中衫金桥生物技术有限公司。

　　1.2  方法  标本采用40g/L甲醛固定，石蜡包埋，免疫组化采用SP法。切片厚4μm，置于载玻片上；常规脱蜡至水洗；30mL/L过氧化氢甲醇溶液室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶活性；山羊血清室温下孵育20min；抗原微波热修复(MMP2和MMP9还需采用胰蛋白酶消化)；PBS洗后滴加一抗50μL，湿盒内4℃冰箱过夜，PBS洗；滴加SP试剂盒中生物素标记的二抗，置37℃ 30min， PBS洗；滴加链霉亲和素辣根过氧化物酶50μL，置37℃ 30min， PBS洗；DAB室温下显色；PBS终止显色；清水冲洗10min后苏木素复染，脱水，透明，封片，照相。用已知为阳性的乳腺癌病理切片的一抗染色为阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。用HMIAS2000型全自动彩色图像分析系统对各指标表达的阳性染色面积及阳性染色的强度进行分析，并自动计算得出积分光度与平均灰度。阳性着色定位于细胞质，为棕黄色或棕褐色。每张切片随机选择10个视野取平均值。所有数据采用SPSS 12.0软件包行独立样本t检验及Spearman等级相关分析进行统计分析。

　　2  结    果

　　正常膀胱上皮MMP2和MMP9均为阴性表达，TIMP3为较低表达。MMP2和MMP9在肿瘤上皮阳性表达细胞和表达强度分布不均匀，在与间质组织、血管临近面以及肿瘤侵袭入膀胱深层组织前缘阳性表达细胞多，表达强度也较强。TIMP3在肿瘤中的表达细胞及表达强度分布相对比较均匀(图1)。膀胱正常组织与膀胱癌组织中MMP2，MMP9和TIMP3的灰度有显著性差异(表1)。随着分级的增加MMP2和MMP9的灰度呈递减趋势，TIMP3的灰度随分级的增加亦呈递减趋势(表2)。MMP2和MMP9的灰度随肿瘤分期的增加呈递减趋势，而TIMP3的灰度与肿瘤分期的改变无明显的相关性(表3)。

　　图1  MMP2、MMP9、TIMP3在膀胱癌中的表达

　　表1  MMP2、MMP9、TIMP3在膀胱癌和膀胱正常组织中平均灰度的比较(略)

　　表2  不同分级膀胱癌组MMP2、MMP9、TIMP3的平均灰度比较(略)

　　表3  不同分期膀胱癌组MMP2、MMP9、TIMP3的灰度比较(略)

　　表4  MMP2、MMP9、TIMP3在膀胱癌中表达的相关性　略

　　3  讨    论

　　本实验显示正常膀胱黏膜下及肌肉间隔组织中的MMP2和MMP9呈阴性表达或表达很低，说明在正常膀胱上皮中MMP2和MMP9基本无酶活性。而在膀胱移行细胞癌中， MMP2、MMP9的灰度明显下降，即它们的表达发生了明显增强，说明MMP2和MMP9的表达水平可用于膀胱癌的诊断。阳性表达位于癌细胞胞浆，细胞间质和部分肿瘤组织间质内，以肿瘤细胞表达为主,胞浆呈不同程度，基本均匀的棕色染色，阳性表达主要分布在间质、血管临界面及癌侵入膀胱深层组织前缘，特别是呈浸润性生长的癌组织周围表达较强，而在肿瘤团块内部阳性细胞相对反而较少。本研究也显示肿瘤间质中的MMP2、MMP9的表达强度多数高于正常间质，且分布不均匀，位于肿瘤细胞的邻界面表达较高。以上资料说明随着肿瘤的生长，肿瘤细胞产生的MMP2、MMP9蛋白也越来越多，使其穿透基质的能力明显增强，有利于肿瘤的转移。验证了肿瘤组织中的MMP2、MMP9在某种程度上参与肿瘤的侵袭和转移。TIMP3抑制肿瘤侵袭、转移的机制一般认为主要是通过抑制MMPs的活性，它对MMP2、MMP9、胶原酶 1及基质溶素均具有抑制作用。我们的研究发现TIMP3在膀胱癌和膀胱正常组织中均有表达，主要分布在肿瘤细胞的胞浆及细胞间质，阳性染色为基本均匀的棕色染色，分布也比较均匀，在肿瘤团块的边缘及内部表达水平基本一致。我们也发现，TIMP3在膀胱癌中随肿瘤分级的升高而表达增加，但与肿瘤分期无相关性。说明TIMP3的表达只与肿瘤细胞的恶性分化程度相关，而与肿瘤侵犯的范围关系不大。这可能与MMP2、MMP9大量分布于肿瘤浸润前缘而TIMP3是一种结合ECM的非可溶性蛋白的特点有一定关系。TIMP3表达的一些改变可能是非侵袭性膀胱癌预后的一个极有价值的指标\[5\]。有学者研究认为TIMP3发挥抑癌作用，在部分肿瘤中因启动子高甲基化，基因变异等原因而表达下降\[6\]。但也有部分肿瘤组织中TIMP3的表达并非下降，而是升高\[7\]，我们的研究运用免疫组化的方法在膀胱癌中证实了这一点。其原因可能是MMPs的激活刺激了膀胱肿瘤细胞和基质细胞，使TIMP3的表达升高，但TIMP3的升高的程度小于MMPs，致使MMPsTIMPs平衡失调，MMPs净活性增加。它们在膀胱癌微环境中的表达变化还有待进一步研究。综上所述，我们认为联合MMP2、MMP9和TIMP3有望成为膀胱移行细胞癌的预后新的检测指标。免疫组织化学SP法简便、快速、直观，有利于临床推广使用, 高清晰度彩色医学图文分析系统具有客观、快速的优点，综合利用这些技术方法分析染色灰度，对容易出现转移、恶化的高危患者及早综合治疗，有利于提高患者的生存率。其中，TIMP3无论是作为预测肿瘤预后的指标，还是作为肿瘤基因治疗的手段都有可能具有潜在的重要价值。

　　参考文献：

　　\[1\]Bhuvarahamurthy V, Kristiansen GO, Johannsen M, et al. In situ gene expression and localization of metalloproteinases MMP1, MMP2, MMP3, MMP9, and their inhibitors TIMP1 and TIMP2 in human renal cell carcinoma \[R\]. Oncol Rep, 2006, 15(5):13791384.

　　\[2\]Mandal M, Mandal A, Das S, et al, Clinical implications of matrix metalloprotteinases \[J\]. Mol Cell Biochem, 2003, 252(1-2):305329.

　　\[3\]Malemud CJ, Matrix metalloproteinases (MMPs) in health and disease: an overview \[J\]. Front Biosci 2006, 11(1):16961701.

　　\[4\]Visse R, Nagase H. Matrix metaloproteinases and tissue inhibitors of metaloproteinases : structure, function, and biochemistry \[J\]. Circ Res, 2003, 92:827839.

　　\[5\]Martin G, Friedrich, Shahin Chandrasoma, Kimberly D. Siegmund, et al, Prognostic relevance of methylation markers in patients with nonmuscle invasive bladder carcinoma \[J\]. Eur J Cancer, 2005, 41(17):27692778.

　　\[6\]Darnton SJ, Hardie LJ, Muc RS, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase3 (TIMP3) gene is methylated in the development of esophageal adenocarcinoma: loss of expression correlates with poor prognosis \[J\]. Int J Cancer, 2005,115(3):351358.

　　\[7\]Wallard MJ, Pennington CJ, Veerakumarasivam A, et al. Comprehensive profiling and localisation of the matrix metalloproteinases in urothelial carcinoma \[J\]. Br J Cancer, 2006, 94(4):569577.

　　通讯作者：张旭(1962)，男，教授，博士生导师，主要从事泌尿外科学；基因工程、实验肿瘤学研究.

　　作者简介：朱宏刚(1977)，男，医学硕士生，住院医师. Email: whhgzhu@163.com   

　　华中科技大学同济医院泌尿外科，湖北武汉  430030

　　(编辑  钱春梅)