肾细胞癌MMP9、VEGF表达与MVD的相关性

【摘要】  目的 探讨基质金属蛋白酶9（MMP9）与血管内皮生长因子（VEGF）在肾癌组织中的表达及其与血管生成、肿瘤侵袭和转移的关系。方法 采用免疫组织化学SP法，检测75例肾细胞癌、12例正常肾组织中MMP9与VEGF的表达情况；CD34免疫组化染色方法标记微血管内皮计数微血管密度（MVD）。结果 肾癌组织MMP9与VEGF表达均明显高于正常肾组织（F=13.12、9.76;q=4.568～9.333;P<0.05）,不同病理类型的肾癌组织中MMP9与VEGF表达差异均无显著性（q=0.035～2.209,P>0.05），不同临床分期肾癌组织MMP9与VEGF表达差异均有显著性（F=24.95,3.54;q=3.086-11.846;P<0.05）。MVD与VEGF、MMP9蛋白表达之间均呈显著正相关(r=0.381、0.375，P<0.05)，VEGF与MMP9蛋白表达之间也有显著相关性(r=0.507,P<0.05)。结论 MMP9、VEGF与肾细胞癌的血管生成有关， MMP9与VEGF表达检测可作为反映肾细胞癌侵袭和转移潜能的生物学指标 。

【关键词】  基质金属蛋白酶类 血管内皮生长因子类 肾肿瘤 新生血管化 病理性

    EXPRESSION OF MMP9 AND VEGF IN THE TISSUES OF RENAL CARCINOMA AND ITS CORRELATION WITH MVDSUN RUILI, WANG SHOUBIAO(Department of Anatomy, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China） ［ABSTRACT］ObjectiveTo study the expressions of MMP9 and VEGF in renal carcinoma, and their correlation with angiogenesis, tumor invasion and metastasis. MethodsExpressions of MMP9 and VEGF were detected immunohistochemically in tissue from the carcinoma (RCC, n=75) and normal renal tissue (n=12). The MVD was estimated via counting the number of endothelium displayed by CD34 expression.ResultsExpressions of MMP9 and VEGF in RCC were significantly higher than that of normal renal tissue (F=13.12;9.76;q=4.568-9.333;P<0.05), which were not related to pathological type (P>0.05), but related to clinical staging (F=24.95,3.54;q=3.086-11.846,P<0.05).  A positive correlation between MVD, MMP9 and VEGF was observed (r=0.381,0.375;P<0.05).ConclusionMMP9 and VEGF correlate significantly with angiogenesis in RCC, suggesting of expressions of MMP9 and VEGF may be biological indexes in detecting invasion and metastasis of RCC.

    ［KEY WORDS］matrix metalloproteinases; vascular endothelial growth factors; kidney neoplasms; neovascularization, pathologic

    基质金属蛋白酶类（MMPs）是一组具有共同生化性质的可降解细胞外基质的酶,目前至少已发现14种[1]。它们的细胞来源不同，所降解的底物亦不同，但它们都能在中性pH环境下发挥作用，都能协同地降解细胞外基质的绝大多数生物大分子物质。目前的研究表明，MMPs与肿瘤的侵袭和转移关系相当密切[2，3]。

    MMP9水平与活跃的新生血管生成有关[4]。血管内皮生长因子（ VEGF）是一种能强烈诱导血管生成的细胞因子，可通过促进血管生成而影响肿瘤的生物学行为。肾癌是富含血管的实体肿瘤，和其他实体肿瘤一样，血管生成可能在肿瘤的发生、发展以及侵袭和转移中发挥重要作用。微血管密度(MVD)是公认的评价血管生成的指标。MMP9与VEGF在肺癌等中的表达与临床关系已有报道[5]，而在肾癌中表达的研究国内较少。本文研究MMP9、VEGF在肾癌组织的表达情况，并探讨MMP9、VEGF在肾癌血管生成以及肿瘤侵袭和转移中的作用，从而为临床早期判断肾癌的生物学行为和寻求新的治疗途径提供一定的参考资料。

    1  材料和方法

    1.1  材料及其来源

    75例肾细胞癌石蜡包埋组织均来自聊城市人民医院2000年2月～2005年12月手术切除的肾细胞癌标本，均经病理学检查确诊。75例病人中，男49例，女26例；年龄26～75岁，平均54.1岁。按ROBSON分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期29例，Ⅲ期12例，Ⅳ期15例。有淋巴结转移17例，腰椎转移2例。采用最新组织学分型标准[6]分为：肾透明细胞癌51例，乳头状癌9例,嫌色细胞癌3例，未分类型及其他12例。75例均行手术治疗，其中72例行肾癌根治术，3例行姑息性肾切除。12例对照组肾组织均取自远离肿瘤2 cm以上的正常肾组织。

    1.2  检测方法

    采用免疫组织化学SP法检测，即用型兔抗人MMP9、VEGF、CD34，SP试剂盒均购自北京中山生物工程公司。将肾癌组织和正常肾组织石蜡包埋，5 μm厚标准切片，脱蜡至水，体积分数0.03 H2O2灭活内源性过氧化物酶，0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液中抗原热修复，使用体积分数0.05～0.10正常山羊血清封闭，滴加兔抗人MMP9、VEGF或CD34工作液孵育，依次滴加生物素标记二抗，辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育，DAB显色，脱水，透明，中性树胶封片。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，用已知阳性乳癌石蜡切片作为阳性对照。

    1.3  结果判定

    1.3.1  MMP9、VEGF免疫组化染色结果的判定利用德国Simple PCI图像分析系统进行灰度测量,将免疫组化染色结果转化为灰度值进行定量分析。每张切片以组织间质空白处入射光的值为定标，每张切片选取5个视野(200倍),分别测定间质灰度及癌巢灰度,取其平均值,以净灰度值作为MMP9、VEGF表达的测定值[7]。测定值=间质灰度值-癌组织灰度值。

    1.3.2  MVD结果判断  参照WEIDNER等[8]的方法计算。切片在100倍光镜下挑选微血管分布最高密度区域,在200倍光镜下计数5个不重复视野中被CD34染成棕黄色的微血管数,取其平均值作为MVD。每个与邻近微血管明显分离的阳性染色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇都视为独立的微血管;只要结构不相连,其分支结构也计为一个血管。而直径大于8个红细胞的血管、有厚的平滑肌的血管及硬化区的血管不在计数范围内。

    1.4  统计学处理

    数据处理采用SPSS 11.0统计软件，组间显著性检验采用单因素方差分析(ANOVA)，组间多重比较采用Scheffe法，蛋白表达之间的相关分析采用Spearman法。

    2  结    果

    2.1  MMP9 、VEGF蛋白的表达

    MMP9主要表达于肾癌细胞及部分间质细胞胞浆、胞膜及基质成纤维细胞中，血管内皮细胞亦有表达。正常对照组主要表达于近曲、远曲肾小管上皮细胞胞浆或胞膜。VEGF主要表达于肾癌细胞及部分血管内皮细胞的胞浆。正常对照组主要表达于近曲、远曲肾小管上皮细胞胞浆或胞膜。

    肾癌组织MMP9、VEGF的表达均显著高于正常肾组织(F=13.12、9.76，q=4.568～9.333,P<0.05)；不同病理类型的肾癌组织中MMP9与VEGF表达差异均无显著意义（q=0.035～2.209,P>0.05）；不同临床分期肾癌组织中的MMP9、VEGF表达差异有显著意义（F=24.95、3.54，q=3.086～11.846,P<0.05）。见表1。

    2.2  MMP9 、VEGF与MVD之间的关系

    肾癌组织的MVD显著高于正常肾组织(F=12.15,q=3.608～9.021,P<0.05)；且不同临床分期肾癌组织MVD差异均有显著意义 (q=3.948～4.431,P<0.05)；淋巴结有转移者MVD明显高于淋巴结无转移者(t=6.83,P<0.05)。

    相关分析显示，MVD与VEGF、MMP9蛋白表达呈显著正相关(r=0.381、 0.375，P<0.05)；VEGF与MMP9蛋白表达之间也存在显著相关性(r=0.507,P<0.05)。见表1。表1  肾癌组织 MMP9 、VEGF蛋白表达和MVD测定结果

    3  讨    论

    肿瘤发生侵袭和转移时必须首先降解细胞外基质，细胞外基质包括基膜成分(BM)和间质，是肿瘤细胞脱落游走并发生侵袭及转移的主要屏障。肿瘤细胞和间质细胞可分泌MMP9或促进MMP9的表达[9]。MMP9不仅通过降解基底膜和基质成分促进肿瘤的侵袭和转移，还可通过毛细血管增生、新生血管生成等促进肿瘤生长和扩散[10]。本文实验结果显示，肾细胞癌MMP9表达明显高于对照组，MMP9表达随ROBSON分期增高而增加；有淋巴结转移者MMP9的表达明显高于无淋巴结转移者。因此，我们认为MMP9参与了肿瘤的侵袭和转移。本实验结果还表明，不同病理类型肾癌组织MMP9的表达差异无显著性，其原因尚不清楚，推测MMP9在肿瘤的发生、发展中所起的作用可能是一致的。

    实验证明，VEGF是作用最强、特异性最高的促血管生长因子之一[11]，多数实体肿瘤内有VEGF的异常高表达。VEGF主要来自肿瘤自身的分泌，另一小部分则由肿瘤相关的基质所产生。肿瘤诱导VEGF基因激活，VEGF呈周期性分泌，引起肿瘤血管渗透性增高、血浆蛋白外渗和纤维蛋白不断沉积。新的基质和新血管的形成将为肿瘤生长、侵袭和转移提供基础。本文实验结果表明，VEGF在不同临床分期肾癌组织表达差异有显著性。 VEGF的阳性表达主要位于肿瘤区和肿瘤周边区，从而说明VEGF可能参与了肾细胞癌的侵袭和转移。同时，本实验显示， VEGF在晚期肾癌组织高表达，提示VEGF与肾癌的侵袭力密切有关，其原因可能与其强烈诱导肿瘤血管生成有关，确切机制有待于进一步探讨。我们认为VEGF 可以作为预测肾细胞癌侵袭和转移潜能的生物学指标。

    VEGF是目前己知的诱导血管生成最强烈的细胞因子之一，与多种肿瘤的血管生成有关。本文结果显示，VEGF的表达与MVD呈显著正相关，说明VEGF在肾细胞癌的血管生成中起十分重要的作用。本文结果还显示，MVD与MMP9呈显著正相关，表明MMP9亦参与了肾细胞癌的血管生成。在肾细胞癌组织中，VEGF和MMP9的表达呈显著性相关性，表明VEGF和MMP9对肿瘤血管生成可能具有协同作用，与RIEDEL等[12]对头、颈鳞状细胞癌研究结果一致。目前，这种协同作用的机制尚不十分清楚，可能与以下几个方面的原因有关:①MMP9在降解血管基膜和细胞外基质的同时，可能通过某些信号传导途径激活内皮细胞、肿瘤细胞表达VEGF；②在肿瘤发生过程中，癌基因可同时激活多种基因的表达，包括VEGF和MMP9基因。

    综上所述，MMP9和VEGF都参与了肾细胞癌的血管生成，并在此过程中可能有相互促进作用，对其协同作用机制的阐明无疑对控制肾细胞癌的侵袭和转移具有十分重要的意义,

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作者单位：青岛大学医学院人体解剖学教研室,山东 青岛 266021