金黄色葡萄球菌δ溶血素分泌特点的初步研究

【摘要】  　　目的 通过检测不同金黄色葡萄菌菌株不同时间点δ溶血素的分泌，观察其分泌的特点，为进一步的研究打好基础。方法 采用高效液相色谱法（HPLC）检测不同菌株、不同时段的δ溶血素的分泌量，绘制其与生长时间、细菌生长量的关系曲线。结果 在检测的8株金黄色葡萄菌中，δ溶血素的分泌存在着明显的菌株间的差异；其分泌的量时间曲线呈现“S”型，可分为分泌量微量增加、快速增加、平缓增加三个时期。结论 δ溶血素的分泌反映了金黄色葡萄球菌密度感应系统（agr system）调控外毒素分泌的特点。

【关键词】  δ溶血素　金黄色葡萄球菌　高效液相色谱法

　　Study on δhemolysin secretion in staphylococcus aureus

　　GUO Li  JIANG Shujun  QIU Xiaoqing

　　Department of Physiology, Binzhou Medical University, Binzhou  256603

　　【Abstract】  Objective  For the further study, we attempt to acquaint ourselves with the secretion of δhemolysin in staphylococcus aureus.Methods  The amount of δhemolysin from different strains and growth phases is analyzed by high performance liquid chromatography(HPLC) and the curve of the amount of δhemolysin  vs growth time was drawn.Results  It is observed that the secretion of δhemolysin is various in different S. aureus strains and different growth phases, the curve of δhemolysin secretion is synchronous with that of bacterial growth and can be divided into three phases.Conclusion  The secretion of δhemolysin well reflects the regulation of access gene regulation (agr) system in S.aureus.

　　【Key words】  Deltahemolysin,staphylococcus aureus,HPLC

　　金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是人类主要的致病菌之一［１］，可引起败血症、毒素休克综合征（TSS）、心内膜炎、泌尿道感染、皮肤脓肿、食物中毒和伤口感染等，其致病性主要是因其能分泌20多种蛋白毒素。其中大部分蛋白毒素的合成主要受一个被称为“数量阈值感应”系统（quorumsensing system，QS）的调控［2］。在金葡菌中，该系统由agr基因座（accessory gene regulator locus）编码，称agr system，近年来成为细菌毒素分泌调节研究［3］及新型抗菌药物研发的热点［4，5］。
   
　　δ溶血素（δhemolysin）是致病性金葡菌产生的四种重要的溶血素之一，其分泌的变化情况可间接反映agr 系统的活动情况［6］。
   
　　本研究的目的是首先建立在我们的实验系统下用HPLC检测δ溶血素的方法，其次观察δ溶血素在不同菌株，不同生长时段的分泌情况，为更深层的研究打好基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  主要仪器及试剂  AKTA purifier 色谱仪（Amersham Pharmacia Biotech），紫外检测器（UV900），Resource PHE 1ml 色谱柱（Amersham Pharmacia Biotech），低温离心机（Avanti J25, Beckman couter），乙腈（SigmaAldrich Laborchemikalien），tryptone（Oxoid），yeast extract（Oxoid），其它均为国产分析纯。

　　1.2  菌株及生长条件  金黄色葡萄球菌ATCC 29213（耐青霉素的标准菌株），BAA42（耐甲氧西林MRSA），均购自ATCC（American Type Culture Collection），其它株为华西医院临床分离的MRSA菌株，采用BM（basic medium）培养基：10 g/L tryptone，5 g/L yeast extract，5 g/L NaCl，1 g/L Glucose，1 g/L K2HPO4。我们的培养体系为：过夜培养菌液按1∶100的比例接种到新鲜BM培养基中培养（初始菌量约为5×107 CFU/ml，三角烧瓶与培养基体积比为10∶1）,37 ℃，210 r /min振荡培养。以下实验均按此体系进行培养。

　　1.3  HPLC实验条件的建立

　　1.3.1  样品的制备 ：将金黄色葡萄球菌按上述条件培养8 h，取菌液，19 000 r/min离心5 min，上清经0.22 μm过滤，进行HPLC分析（从离心至上样分析的各步操作均在冰上进行）。

　　1.3.2  洗脱条件的优化：参考Michael Otto 的方法［7］。缓冲液A为1 ml/L三氟乙酸（TFA）/100 ml/L乙腈（acetonitrile），缓冲液B为1 ml/L TFA/900 ml/L acetonitrile。采用0%～100%B的线性梯度洗脱，根据洗脱曲线调整洗脱条件，达到最佳分离。

　　1.3.3  上样量的确定：先以1 ml 为经验上样量，然后根据不同菌株各自的检测结果调整上样量。

　　1.4  金黄色葡萄球菌生长曲线与δ溶血素分泌时间曲线的绘制  接种金黄色葡萄球菌后，每隔1 h取2 ml菌液,其中100 μl加入96孔板中于波长595 nm处检测光吸收值A595，剩余菌液进行HPLC分析。重复三次，绘制生长曲线和δ溶血素的分泌量的曲线。

　　2  结果

　　2.1HPLC检测条件的确定经过反复的实验比较最后确定HPLC检测条件为：上样后先采用6个柱体积的11.1%B的缓冲液洗脱杂峰，然后以11.1%～ 100%B的线形梯度洗脱。上样流速为1 ml/min，其它均为2 ml/min，在我们的洗脱条件下，δ溶血素的保留时间约为11 min。上样量则根据不同菌株的δ溶血素的分泌量而定，范围为600～2 000 μl。

　　2.2  不同菌株δ溶血素分泌量的分析  我们检测了实验室现有的8株金黄色葡萄球菌的δ溶血素的分泌量，发现虽然有同样的生长时间及相似的光密度，但不同的菌株其分泌量存在很大的差异，即使均为MRSA菌株，δ溶血素的分泌量也不相同。菌株ATCC29213的δ溶血素的洗脱峰远远高于菌株BAA42（菌株洗脱曲线图略）。

　　2.3  HPLC对同一菌株不同生长时段的δ溶血素的分泌量分析  取不同生长时段的菌液进行δ溶血素浓度的检测，并绘制δ溶血素的分泌量时间曲线及菌液的OD值生长时间曲线。从图1可以观察到在菌的生长初期δ溶血素微量分泌，随着菌密度的增大分泌量缓慢增加，当菌进入指数生长后期后δ溶血素分泌量迅速增加，进入菌生长的静止期后，分泌量增加的幅度又趋变缓。整个分泌过程呈现出与菌的生长曲线图形相近的变化趋势，近似于“S”型，且变化出现的时间要晚于相应菌密度出现变化的时间。

　　图1  金葡萄BAA42 δ溶血素分泌量时间与生长时间曲线（略）
　　
　　3  讨论
   
　　金黄色葡萄球菌是一种最常见的引起院内严重感染的致病菌之一，可引起广泛的感染。与金黄色葡萄球菌致病性密切相关的是调节金黄色葡萄球菌大部分外毒素的分泌的agr系统［8，9］，agr系统是一个密度阈值感应系统，在菌的生长过程中“感知”同类菌的密度，决定菌的生长、基因的表达及毒素的表达。该系统近年来成为降低细菌毒力及研制新型抗菌药物的切入点。δ溶血素不同于金黄色葡萄球菌的其它蛋白毒素，其编码基因hld位于agr系统毒素调节的效应分子 RNAⅢ的编码区域内，与RNAⅢ同转录［6］，所以其分泌量可以间接反映agr系统的活动情况。在本研究中我们首先优化了HPLC法检测δ溶血素的条件，对δ溶血素的进行最佳的分离和检测，然后检测了不同菌株及菌株不同生长时段的分泌情况，以期对δ溶血素的分泌情况有更加清楚的了解，为进一步实验打好基础。
   
　　δ溶血素的分泌与菌株的密度直接相关，在细菌生长初期分泌量少，当细菌进入指数生长后期时，分泌量明显增加，至细菌生长进入静止期以后，其分泌量的增加趋势渐趋平缓，δ溶血素的分泌曲线可分为分泌量微量增加段、快速增加段及缓慢增加段，与细菌的生长曲线的形状很相似，但时程上与后者约有1 h的延后。金黄色葡萄球菌毒素分泌所呈现的这一趋势与其密度阈值感应系统（主要为agr系统）的调节密不可分［10］。细菌通过感应生长介质中自身释放的信号分子，又称自身诱导分子（autoinducer，AI），来判断同类菌的数量，调节基因的表达，而AI分子浓度与细菌的密度密切相关。当AI分子浓度达到阈值时，就会激活agr基因座的两个效应分子RNAⅡ和RNAⅢ的转录，前者上调与AI分子合成分泌有关的基因，后者本身编码δ溶血素，并且上调诸如α溶血素、毒素休克综合征毒素（TSST1）、肠毒素B等多种重要毒素基因的表达［2］，使整个菌群快速一致地产生大量毒力因子；在菌生长后期，由于营养物质的逐渐耗竭，有害代谢产物的积累，细菌的繁殖越来越慢，生理代谢活动也趋于停滞。以上整个调节过程对于细菌的生存和繁殖具有重要意义：病原菌在密度很低时仅产生微量的毒力因子，可逃避宿主的免疫防御系统的识别，当细菌密度达到一定数量后，就会大量产生毒力因子，对宿主产生较大的影响；当密度过高时又会降低代谢以延长生命。
   
　　不同的菌株δ溶血素分泌的量和时程可以有很大的差别。通过检测我们对实验室已有的菌株的δ溶血素分泌情况有了大致的掌握，我们认为分泌能力高的菌株及分泌量大的指数生长后期和静止期前期可分别作为待检菌株和时间段，可以更加灵敏的反映加入干预措施后的变化，为下一步检测药物对agr系统的作用打好基础。

【参考文献】
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　　［3］Podbielski A, Kreikemeyer B. Cell densitydependent regulation: basic principles and effects on the virulence of Grampositive cocci［J］. Int J Infect Dis, 2004 ，8(2):8195.

　　［4］Qiu XQ, Wang H,Lu XF,et al. An engineered multidomain bacterial peptide as a model for targeted antibiotics against specific bacteria［J］. Nature Biotechnol, 2003，21(12):14801485.

　　［5］Dell'Acqua G, Giacometti A, Cirioni O. Suppression of drugresistant staphylococcal infections by the quorumsensing inhibitor RNAIIIinhibiting peptide［J］. J Infect Dis,2004，190(2):318320.

　　［6］Janzon,Lofdahl LS,Arvidson S. Identification and nucleotide sequence of the deltalysin gene, hld, adjacent to the accessory gene regulation（agr）of Staphylococcus aureus［J］. Mol Gen Genet，1989，219:480485.

　　［7］Otto M, Gotz F.Analysis of quorum sensing activity in staphylococci by RPHPLC of staphylococcal deltatoxin［J］. Biotechniques ，2000，28:10881096.

　　［8］Yarwood JM, Schlievert PM. Quorum sensing in Staphylococcus infections［J］. J Clin Invest, 2003，112(11):16201625.

　　［9］Miller MB,Bassler BL. Quorum sensing in bacteria［J］. Ann Rev Microbiol,2001，55:165169.

　　［10］Ji GY, Beavis R,Novick RP,et al. Cell density control of staphylococcal virulence mediated by an octapeptide pheromone［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1992，92(12):12055.

作者单位：滨州医学院生理学教研室 滨州市 256603；四川大学卫生部移植工程与移植免疫重点实验室