甲状旁腺激素治疗去势大鼠颅骨缺损的研究

【摘要】  目的 研究间歇性皮下注射甲状旁腺激素（PTH）对去势大鼠骨缺损修复的血钙、磷和PTH变化的影响，为更年期骨质疏松治疗提供实验基础。方法 在建立Wistar大鼠骨质疏松模型的基础上，在颅骨人为制造8 mm的缺损，同期植入大鼠自体骨，将大鼠随机分为对照组、去卵巢组和去卵巢后采用PTH134间断给药组，分别于7 、14 、21 、28和56 d抽取血样，检测血钙、磷浓度及PTH浓度变化。结果 自体骨植入术后，去卵巢未治疗组大鼠血钙明显低于其它两组，而血磷明显升高，PTH治疗组与对照组血钙、磷浓度没有明显差异。PTH活性在去卵巢组表现为明显增高，大于其它两组；而用PTH134治疗组的PTH活性则变化不是很明显，与对照组无统计学差异。结论 骨质疏松状态下，PTH血清活性与血钙的浓度成负相关性，而与血磷的浓度呈正相关性。PTH间断用药有助于去势大鼠血钙浓度的维持。

【关键词】  甲状旁腺激素；骨质疏松；去势大鼠

    Effect of parathyroid hormone fragment134 on bone reconstruction in ovariectomized rats

    LIU Yunqi  LIU Xiaoli  ZHANG  Qihong  et al

    Department of Nephrology, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou 256603

    【Abstract】   Objective  To investigate the effects of intermittence parathyroid hormone fragment 134 on blood Ca2+, PO43- and PTH concentration in ovariectomized rats (OVX).  Methods  Twentyfour 6month Wistar rats were divided into 3 groups randomly, sham, OVX and OVX treated by PTH134. The Bone Mineral Density of 6 rats selected randomly were valued and confirmed osteoporosis models. The others with 8mm defect in skull were operated, while autograft was embedded in defects. The 6 OVX rats among them were treated for 56 days with PTH134 (40 μg/(kg·d）, once three days) or vehicle as OVX control group respectively. All of the samples of blood were collected while rats were sacrified. The Ca2+ , PO43- and PTH concentration were valued.Results  After operation, Ca2+ of OVX was lowest among three groups, but PO43- higher. While OVX treated with PTH and sham had no difference. PTH concentration of OVX increased higher than others.Conclusion  PTH and Ca2+ concentration reversed，as well as the PTH and PO43- fluctuated with the same trend under osteoporosis.

    【Key words】   parathyroid hormone,  osteoporosis,  ovariectomized rats

    骨替代材料在种植修复中的应用已经很普遍［１］。中老年妇女由于绝境后雌激素水平的降低，导致骨质疏松现象尤为突出［２］，是骨替代材料应用的重要人群之一。在治疗骨质疏松的药物研究中，甲状旁腺激素（PTH）被认为是很有潜力的有效药物［3］。本实验建立去卵巢大鼠模型模拟更年期骨质疏松状态，并认为形成大鼠颅骨缺损，同期植入自体骨修复，采用间断皮下注射PTH134，监测PTH对骨质疏松状态下血Ca2+、PO43-和 PTH浓度变化的情况，为PTH临床应用提供参考。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  选用雌性Wistar大鼠24只, 6月龄，体重200～245 g，购自四川大学实验动物中心。按随机数字表平均分为三组：去双侧卵巢组（OVX），去双侧卵巢加药物治疗组（OVX+PTH）和伪手术对照组（sham）。

    1.2  骨质疏松模型建立  戊巴比妥钠30 mg/kg体重腹腔麻醉，采用经大鼠双侧腰背部侧切口进入腹腔切除双侧卵巢（经组织学证实），伪手术组切除卵巢附近约1 g脂肪组织。60 d后从两组中各随机抽取6只大鼠测定股骨骨密度。所有大鼠同样条件下喂养，自由进食、进水、食用标准颗粒饲料。术后肌注青霉素20万U/（只·次），每天2次，连续注射3 d。

    1.3  颅骨缺损制备和自体骨的植入  其余18只大鼠进行颅骨缺损制备，麻醉方式同前。行颅顶纵切口,显露颅骨并剥除部分骨膜，流水降温下用牙科钻制备一直径8 mm全层骨缺损，生理盐水冲洗后植入自体骨，并关闭伤口。分别于术后7、14、21、28 d和56 d收取血样检测Ca2+、PO43-和PTH浓度变化。

    1.4  PTH134给药  PTH134（Sigma，USA）对其中设计为去卵巢同时给于PTH134治疗组Wistar大鼠，按照40 μg/kg的剂量每天给于肌肉注射。单纯去卵巢组每天给予生理盐水0.2 ml/只，每3天注射一次，在第54天注射最后一次。

    1.5  观察指标  应用单光子大鼠骨矿测定仪（中国测试技术研究院）测定去卵巢60 d大鼠股骨骨密度值并判断骨质状态；采用OCPC法（邻甲酚络合物和钙离子生成红色络合物），选用北京柏定生物工程公司生产的钙、磷检测试剂盒。将样品放入美国PE公司HTS 7000 plus多孔分析仪中，在570 nm波长读数。通过将原始吸光度减去本底吸光度，再除以标准管OD值，乘以2.5 μmol/ml的标准值，即得到样本的钙含量（μmol/100 ml）。采用Elecsys PTH kit (Roche Diagnostic，USA)，E170A（Roche，Japan）全自动实验分析仪检测血PTH活性变化。

    1.6  统计学分析  用SPSS12.0 统计软件包进行统计学分析，实验资料各组统计量以均数±标准差（ x±s）表示，方差齐性检验后行成组设计资料的t 检验。

    2  结果

    2.1  大鼠股骨骨密度测定结果  去卵巢组（0.415 ±0.021）g/cm2，对照组（0.537±0.006)g/cm2，去卵巢组明显低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.01），说明骨质疏松模型已经建立。

    2.2  PTH134对血清Ca2+和PO43-水平的影响（见表1，2）  PTH134 治疗56 d后，与对照组血清钙、磷值比较，无统计学意义；而安慰剂组则表现出低钙和高磷的变化，与对照组和PTH134治疗组都有明显差别。表1  去势大鼠血Ca2+浓度变化表2  去势大鼠血PO43-浓度变化 注：与对照组比较，★ P＜0.05，△P＜0.01

    2.3  血清PTH水平的变化  安慰剂组的血PTH水平明显高于对照组和PTH134治疗组，而对照组和PTH134治疗组的血清PTH水平变化不明显，治疗组较对照组轻度增高，但没有统计学意义（表3）。表3  去势大鼠血PTH浓度注：与对照组比较，★P＜0.05，△P＜0.01

    3  讨论

    PTH是甲状旁腺细胞合成分泌的一种单链多肽分子，是调节细胞外液钙磷浓度的主要激素，其作用是维持血钙和血磷浓度处于正常水平，其靶器官是肾脏、骨骼和小肠［4］。PTH作用靶细胞膜上的腺苷酸环化酶系统，增加胞浆内的cAMP及焦磷酸（PPi）水平［5，6］。PTH对骨的作用有双重性，持续作用可以引起破骨细胞增殖，活性增加，分泌多种水解酶产生大量的乳酸和柠檬酸等酸性物质，使骨基质和骨盐溶解，释放钙和磷到细胞外液。PTH间断刺激则可以刺激骨细胞分泌胰岛样素样生长因子1（IGF1），从而促进骨胶原和基质的合成，有利于成骨作用［7］。PTH其对血磷的影响是通过促进肾远曲小管对Ca2+的重吸收，降低肾磷排泄阈，并抑制肾脏对磷的重吸收，最终导致血Ca2+升高，血磷降低。从而使血钙、磷比例保持恒定［８］。

    体内PTH分泌受到血浆Ca2+浓度变化的影响，血Ca2+轻度降低，就可以使甲状旁腺分泌PTH明显增高［８］。本试验结果提示PTH与血浆中的钙磷浓度存在一定的相关性。其中单纯去卵巢组（OVX）中，血Ca2+降低的同时，PO43-和PTH浓度明显升高，大于对照组，有统计学决义。而采用PTH间断给药组，Ca2+、PO43-和PTH浓度变化并不明显，同对照组比较，无统计学意义。说明外源性的间断给药，对维持血浆中的PTH正常浓度有一定的作用。究其机制，可能是通过调节肾脏的磷吸收量，升高血钙，进而抑制内源性的PTH分泌，使PTH活性维持在一个较为恒定的生理水平。本实验通过检测Ca2+、PO43-和PTH浓度变化，可以一定程度的反映出间断皮下注射PTH134对骨质疏松症的疗效的影响机制，对临床应用有一定的指导作用。

【参考文献】
  ［1］　 Webster TJ, Ergun C, Doremus RH, et al. Enhanced functions of osteoblasts on nanophase ceramics［J］. Biomaterials, 2000, 21(13):18031810.

［2］ Silverberg SJ, Shane E, Dela Cruz L, et al. Skeletal disease in primary hyperparathyroidism［J］. J Bone Miner Res，1989,4(3): 283291.

［3］ Rubin MR, Cosman F, Lindsay R,et al. The anabolic effects of parathyroid hormone［J］. Osteoporos Int，2002，13(4):267277.

［4］　 Rubin MR, Bilezikian JP. The potential of parathyroid hormone as a therapy for osteoporosis［J］. Int J Fertil Womens Med，2002,47(3):103115.

［5］ 王洪复, 金慰芳, 高建军, 等.重组人甲状旁腺激素对去卵巢大鼠骨质疏松的治疗作用［J］. 中国医学科学院学报, 2003, 25(3)：275278.

［6］ Girotra M, Rubin MR, Bilezikian JP. The use of parathyroid hormone in the treatment of osteoporosis［J］. Rev Endocr Metab Disord，2006，7(12):113121.

［7］　Rubin MR, Bilezikian JP. Parathyroid hormone as an anabolic skeletal therapy［J］. Drugs， 2005，65(17):24812498.

［8］ Bauer DC, Garnero P, Bilezikian JP,et al. Shortterm changes in bone turnover markers and bone mineral density response to parathyroid hormone in postmenopausal women with osteoporosis［J］. J Clin Endocrinol Metab， 2006，91(4):13701375.

作者单位：滨州医学院附属医院肾内科 滨州市 256603