基质金属蛋白酶2 mRNA在子宫内膜异位症中的表达及意义

【摘要】  目的 研究基质金属蛋白酶2（MMP2）mRNA在子宫内膜异位症异位内膜和在位内膜组织中的表达，探讨MMP2在子宫内膜异位症发生发展中的作用。方法 分别选取子宫内膜异位症异位内膜组织50例、在位内膜组织22例和对照组正常子宫内膜组织20例为研究对象，应用半定量逆转录聚合酶链反应技术（RTPCR）检测MMP2 mRNA的表达。结果 ①MMP2 mRNA在异位症异位内膜组织中均有表达，其相对表达量为（0.6210±0.0870），明显高于正常子宫内膜组织（0.5170±0.0760）和在位内膜（0.5360±0.0840），差异均有显著性（P＜0.05）。而在异位症在位内膜与正常子宫内膜之间差异无显著性（P＞0.05）；②在子宫内膜异位症患者在位内膜中，MMP2 mRNA的表达与正常内膜相比，差异无显著性（P＞0.05）。而且受月经周期的影响，呈现周期性变化。③异位症异位内膜组织中MMP2 mRNA的表达与rAFS临床分期没有相关性，差异没有显著性（P＞0.05）。④正常子宫内膜与异位症在位内膜组织中MMP2 mRNA的表达均受月经周期的影响而呈现周期性变化，分泌期的表达明显高于增生期（P＜0.05）；而在异位症异位内膜组织中，二者的表达则失去其在在位内膜组织中的周期性变化，增生期与分泌期无显著差别（P＞0.05）。结论 ①异位内膜组织不仅具有分泌MMP2的能力，而且表达强度明显高于正常内膜，使异位内膜组织具有侵袭腹膜及周围组织的能力，并且在盆腔、腹膜内不断种植生长，在子宫内膜异位症的发生发展中发挥重要的作用。②MMP2在异位内膜组织中呈高表达，但不随rAFS临床分期的增高而增高，因此认为子宫内膜异位组织各期均有侵袭性，这是异位症病情进行性加重的原因之一。③MMP2在异位内膜组织中的表达失去其在正常子宫内膜组织中的月经周期性变化，这可能是临床上应用激素治疗异位症失败的原因之一。

【关键词】  子宫内膜异位症；基质金属蛋白酶2；在位内膜；异位内膜；逆转录聚合酶链反应

   The expression and significance of matrix metalloproteinase2 mRNA in endometriosis

    LI Quanxiang  GUO Xinhua  GAO Jing

    Department of Obstetrics & Gynecology,Peoples' Hospital of Dongying,Dongying  257091

    【Abstract】  Objective  To investigate the expression of matrix metalloproteinase2(MMP2)mRNA in eutopic and ectopic endometrium from woman with endometriosis,to determine the role of matrix metalloproteinase2 in the pathogenesis of endometriosis.Methods  Reverse transcritptionpolymerase chain reaction(RTPCR) was employed to detect the gene MMP2 in 50 ectopic endometrium and 22 eutopic endometrium from woman with endometriosis and 20 normal control endometrium.Results  ①The relative amounts of MMP2 gene in ectopic endometrium was (0.6210±0.0870),and significantly higher than that in ectopic endometrium from women with (0.5360±0.0840) and without (0.5170±0.0760)endometriosis (P＜0.05).②Their expression was irrespective of the phase of menstrual cycle because no difference was found between proliferous and secretory endometriotic endometrium.③The expression of gene of MMP2 in eutopic endometrium from women with and without endometriosis,was significantly relevant to the phase of the menstrual cycle(P＜0.05),while that in ectopic endometrium was not(P＞0.05).Conclusions  ①Endometriotic tissues have capacity to express MMP2 and they are obviously over expressed than in normal endometrium,which make ectopic endometrial tissue have greater capacity to invade peritoneal and surrounding tissues and which may play an important role in the pathogenesis of endometriosis.②The  expression of MMP2 in ectopic endometrium from endometriosis patient is higher than that in normal endometrium,and as endometriosis clinical stage increase,the expression of MMP2 did not strenghen,which play a vital role in the pathogenesis of endometriosis and lead to endometriosis progression.③The expression of MMP2 in ectopic endometrium of endometriosis lost menstrual cycle expression in normal endometrium,which may be one of failure reason of hormone thereby to endometriosis.

    【Key words】  endometriosis,matris metalloproteinase2 eutopic endometrium,ectopic endometrium reverse,transcriptpolymerase chain reaction

    子宫内膜异位症（endometriosis,EM,简称内异症）是指有功能的子宫内膜生长在子宫腔以外的部位。它在育龄妇女中的发病率极高，主要引起痛经和不孕，是干扰年轻妇女身心健康的重要原因之一。

    本实验应用半定量逆转录聚合酶链反应技术（RTPCR），检测MMP2 mRNA在子宫内膜异位症异位内膜和在位内膜组织中的表达，探讨异位内膜侵袭腹膜并在腹腔内种植生长的机制，从而进一步阐明内异症发生发展的机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料来源

    1.1.1  子宫内膜异位症异位内膜组：50例异位症异位内膜组织标本均取自本院2003年10月—2005年10月因异位症而行腹腔或开腹手术的患者，年龄29～50岁，平均年龄（37.5±7.6）岁。其中增生期23例，分泌期27例。异位症分期按1985年美国生育协会修正分期标准（rAFS分期）［1］进行，Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例。

    1.1.2  子宫内膜异位症在位内膜组：22例在位内膜组织标本取自上述因异位症行子宫切除的患者，其中增生期10例，分泌期12例。

    1.1.3  正常子宫内膜组：取自同期因子宫肌瘤行子宫切除术患者正常子宫内膜20例为对照组，年龄45～51岁，平均年龄（33.5±5.5） 岁。其中增生期9例，分泌期11例。

    所有患者术前3个月内均未接受任何激素治疗，术后均经病理学诊断证实。月经周期的划分根据末次月经及病理学诊断结果确定。

    1.2  方法

    1.2.1  组织总RNA的提取：参照TRIzoI试剂盒（美国GIBCOBRL公司产品）说明书讲行。cDNA合成参照反转录试剂盒（美国PROMEGA公司产品）说明书进行。

    1.2.2  MMP2基因的PCR引物参照文献［2］设计，内参照GAPDH基因的PCR引物根据Primer 5.0设计，由上海生物工程技术服务有限公司合成。上游引物序列为5’CCACGTGACAAGCCCATGGGGCCCC，下游引物序列为3’GCAGCCTAGCCAGTCGGATTTGATG；扩增基因片段长度为490 bp。GAPDH基因作为内参照基因，上游引物序列为5’GGATTTGGTCGTATTGGG，下游引物序列为3’GCTCCTGGAAGATGGTGAT；扩增基因片段长度为211 bp，MMP2和GADPH基因的扩增参数为94 ℃ 3 min，循环条件为94 ℃ 45 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

    1.2.3  产物分析：取10 μl  PCR扩增产物置于2%琼脂糖凝胶上进行电泳，相对分子质量为2 000的DNA标准，紫外透射仪下观察结果并拍照。利用VADAS 2.1系统（德国公司）进行图象扫描分析，计算目的基因mRNA的相对含量，即以MMP2/GADPH比值作为MMP2 mRNA的相对含量。所有标本的RTPCR扩增产物均观察到211 bp的GADPH基因扩增条带，证实逆转录所得cDNA的完整性和PCR反应成功。若观察到490 bp条带，表明MMP2基因表达阳性，无490 bp扩增条带则视为无MMP2基因表达。

    1.3  统计学方法  应用SPSS10.0软件包进行t检验。

    2  结果

    2.1  MMP2 mRNA的表达  所有组织标本均检测到内参照基因GAPDH的稳定表达，证实逆转录所得产物cDNA的完整性和PCR反应的成功。MMP2 mRNA的RTPCR扩增片段长度为490 bp，GAPDH的扩增片段长度为211 bp。表1  各组子宫内膜组织中MMP2 mRNA的表达组别nMMP2 mRNAEM异位内膜500.6210±0.0870abEM在位内膜220.5360±0.0840cEM正常内膜200.5170±0.0760    注：a与正常内膜相比，P＜0.01；b与EM在位内膜相比，P＜0.05；c EM在位内膜与正常内膜相比，P＞0.05

    如表1所示，MMP2 mRNA 在50例EM异位内膜组织中均有表达，其相对表达量为（0.6210±0.0870），明显高于正常子宫内膜组织（0.5170±0.0760）和在位内膜（0.5360±0.0840），差异有显著性（t=4.7635，P＜0.01；t=3.8583，P＜0.05）；而在EM在位内膜组织中的表达与正常子宫内膜组织的表达相比无显著差异（t=0.7766，P＞0.05）。

    2.2  MMP2 mRNA的表达与月经周期  在正常子宫内膜和EM在位内膜组织中MMP2 mRNA的表达受月经周期的影响呈现周期性变化，分泌期的表达均高于增生期；但二者在异位内膜组织中的表达则失去其周期性变化，分泌期的表达与增生期相比无显著差异。

    2.3  内异症异位内膜组织MMP2 mRNA的表达与rAFS临床分期  50例内异症异位内膜组织标本MMP2 mRNA及蛋白的表达与rAFS临床分期没有相关性，各期内膜组织的MMP2 mRNA及蛋白的表达无显著性差异（P＞0.05），见表2。

    表2  MMP2 mRNA与rAFS临床分期rAFS分期nMMP2 mRNA阳性Ⅰ～Ⅱ期250.6170±0.0900Ⅲ期170.6220±0.0810Ⅳ期80.6240±0.0850    本实验结果表明，异位内膜组织中MMP2的表达失去其在正常内膜中的周期性变化，异位内膜组织中MMP2 mRNA的表达明显增强。

    3  讨论

    3.1  MMP2与子宫内膜异位症  研究发现，异位内膜组织中虽然存在性激素受体，但与在位内膜相比其受体含量明显降低，并不随月经周期变化［2］，异位内膜对性激素有一定的敏感性，但缺乏对孕酮的正常反应。异位内膜失去月经的周期节律性，可能与异位内膜中孕激素受体相对或绝对缺乏有关。异位内膜组织对孕激素的敏感性下降，这可能是临床应用孕激素治疗内异症疗效欠佳的原因之一。本实验应用半定量逆转录聚合酶链反应技术（RTPCR）检测MMP2 mRNA在50例子宫内膜异位症异位内膜中的表达结果表明：异位内膜组织中MMP2 mRNA均有表达，其相对表达量为（0.6210±0.0870），明显高于正常子宫内膜组织（0.5170±0.0760）和在位内膜（0.5360±0.0840）。

    MMP2是MMPs中降解、变性Ⅳ型胶原明胶的主要成员，也可切割天然Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ型胶原。由于MMP2能降低细胞间的粘附，有利于细胞的移动，增加了子宫内膜上皮细胞的移动能力。MMP2在异位内膜组织的高表达，使其降解ECM的能力增强，使异位的子宫内膜种植能力增加，有助于异位病灶的不断生长。因此认为异位内膜组织较正常内膜组织具有较强的侵袭能力，从而不断侵袭、降解周围的组织，破坏间质细胞连接，使异位病灶不断扩大蔓延。有报道［3］用酶谱法检测发现异位内膜proMMP2活性较在位内膜高，异位内膜比在位内膜具有更强的侵袭性，与本实验结果一致。

    3.2  MMP2 mRNA在位内膜组织中的表达  本实验RTPCR结果表明，MMP2 mRNA在子宫内膜异位症在位内膜中的相对表达量为（0.5360±0.0840），与正常子宫内膜的相对表达量（0.5170±0.0760）相比，差异无统计学意义（t=0.7766，P＞0.05）。说明在位内膜与正常内膜同样没有侵袭性，由此推测异位内膜侵袭性增强可能与腹腔液的内环境有关。月经期脱落的子宫内膜碎片随经血逆流到腹腔，受腹腔内微环境和体内激素水平的影响，MMP2表达增强，导致异位内膜的侵袭性增高，异位病灶不断扩大［4］。其具体作用机制有待于进一步研究。

    3.3  MMP2 mRNA内异症与rAFS临床分期的关系  子宫内膜异位症（EM）是一种慢性进行性疾病，病情往往难以控制而不断加重。根据1985年美国生育协会提出的修正分期法（rAFS分期标准）［1］，将EM分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。

    本实验结果显示，异位内膜中MMP2 mRNA的表达与EM的临床分期没有相关性，MMP2 mRNA在Ⅰ～Ⅱ期的相对表达量为（0.6170±0.0900），Ⅲ期的相对表达量为（0.6220±0.0810），Ⅳ期的相对表达量为（0.6240±0.0850），各期异位灶中MMP2 mRNA的表达没有显著性差异（P＞0.05）。本实验结果与Wenzl等［2］的研究结果一致。实验结果表明，EM各期的异位内膜均有较强的侵袭力，内膜的侵袭能力并没有因病情的严重而增强。病人在发病早期，尽管病灶小，若不及时、有效的治疗，随着病程的延长，病灶将不断向周围组织侵袭和种植，使病灶不断扩大，并在腹膜内形成广泛的粘连，使病情不断加剧。因此，对EM患者早发现、早治疗可有效的控制疾病的发展。

    3.4  MMP2蛋白的表达与月经周期的关系  本实验免疫组化结果显示，在正常子宫内膜和子宫内膜异位症患者在位内膜组织中MMP2蛋白的表达受月经周期的影响呈现周期性变化，在正常子宫内膜分泌期的表达均高于增生期（P＜0.05）。在正常子宫内膜组织中，受孕激素的调节，MMP2呈显周期性的变化。MMP2蛋白的表达主要在分泌晚期、月经期和内膜重建的增生早期，尤以月经期的表达为高。说明MMP2可能在子宫内膜的周期脱落、生长中发挥重要作用。

    MMP2蛋白在异位内膜组织中的表达失去其周期性变化，增生期与分泌期的表达无显著性差异（P＞0.05）。MMP2的表达失去其在正常内膜中的周期性变化，即无论在增生期还是分泌期，MMP2均呈现高表达状态。Bruner等［5］研究发现，异位灶虽然保留了在位内膜对性激素的敏感性，但异位内膜缺乏对孕激素的正常反应，异位内膜中孕激素受体相对或绝对不足。因此，我们认为，MMP2在异位灶中的表达失去周期性变化，可能与PR的缺乏以及异位灶对孕激素的敏感性降低有关，从而导致临床应用孕激素治疗内异症疗效欠佳。

【参考文献】
  ［1］ American Fertility Society.Revised American Fertility Society classification of endometriosis［J］.Fertil Steril,1985,43(3):351352.

［2］ Wenzl RJ,Heinzl H.Localization of matrix metalloproteinase2 in uterine and ectopic implants［J］.Gynecol Obstetr Invest,2002，45(4):253257.

［3］ Bruner KL,Eisenberg E,Gorstein F,et al.Progesterone and transforming growth factorbeta coordinately regulate suppression of endometrial matalloproteinases in experimental endometriosis［J］.Steroids，1999 ，64(9):648531.

［4］ Nisolle M,CasanasRoux F,Wyns C,et al.Immunohistochemical analysis of estrogen and progesterone receptors in endometrium and peritoneal endometriosis:a new quantitative method［J］.Fertil Steril,1999,62:751759.

［5］ Bruner KL,Eisenberg E,Gorstein F,et al.Progesterone and transforming growth factorbeta coordinately regulate suppression of endometrial matalloproteinases in experimental endometriosis［J］.Steroids,2001，65(9):648649.

作者单位：东营市人民医院妇产科 东营市 257091