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【摘要】 目的 观察肺纤维化大鼠肺组织信号转导和转录活化因子1（STAT1）和血小板源性生长因子（PDGF）表达的变化，探讨其在肺纤维化的作用机制。方法 30只Wistar大鼠随机分为博莱霉素组 (BLM组)和对照组(NS组)，①BLM组：气管内灌注BLM（5mg/kg）诱导肺纤维化；②NS组：气管内灌注NS（剂量与用法同上）。于气管内灌注后第7、14和28天各分别处死5只大鼠，右肺支气管肺泡灌洗(BAL)，进行细胞分类、计数；肺组织免疫组化测定STAT1和PDGF蛋白的表达。结果 BLM组肺组织中STAT1和PDGF蛋白表达在第7天达高峰，之后下降，第28天时仍高于NS组（P＜0.05），而且与支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细胞总数密切相关（r值分别为0.892和0.880，P均＜0.01）。结论 肺纤维化发生的可能机制与肺组织STAT1和PDGF的过度表达有关。
【关键词】 肺纤维化；博莱霉素；信号转导和转录活化因子；血小板源性生长因子
The expressions of STAT1 and PDGF in lung tissue of pulmonary fibrosis rats induced by bleomycin
LIU Jinping ZHAI Nailiang FAN Xianming et al
Department of Pharmacology,Binzhou Medical Univercity, Binzhou 256603
【Abstract】 Objectives To study the expressions of STAT1 and PDGF in lung tissue of pulmonary fibrosis model induced by bleomycin in rats, and discuss the possible mechanism.Methods Thirty Wistar rats were randomly divided into two groups (15 in each group), they were bleomycin group (BLM group) and control group (NS group). ①The BLM group was intratracheally instilled with belomycin (BLM) (5mg/kg)；② NS group was intratracheally instilled with saline (5mg/kg). Five rats in each group were sacrificed at 7，14，and 28 days after intratrachel instillation. The bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of right lung was gotten and the cells counting as well as differentiation was figured out. Lung expressions of STAT1 and PDGF protein were assessed by immunohistochemistry. Results The expressions of STAT1 and PDGF protein in BLM group were the highest at 7th and still elevated over NS group at day 28. The expressions were correlated with the counting of cells，respectively(r=0.892 and 0.902，P＜0.01). Conclusion The hyperexpressions of STAT1 and PDGF protein in lung may be the mechanism of pulmonary fibrosis.
【Key Words】 pulmonary fibrosis ,bleomycin , signal transduction and activation of transcription-1(STAT1) ,PDGF
博莱霉素(bleomycin，BLM)致大鼠肺纤维化模型被广泛用于肺纤维化的研究，其病理过程可分为两个阶段, 即早期( 1～7 d)的肺泡炎阶段和后期( 14～28 d)炎性损伤过度修复的肺纤维化阶段, 其中第7天肺泡炎症最为明显。信号转导和转录活化因子1(signal transduction and activation of transcription 1，STAT1)是STAT家族中最早被发现并克隆的成员，JAK／STAT1信号转导通路参与了某些细胞因子、生长因子、激素以及趋化因子等的信号传导，与炎症性疾病的发生、发展密切相关。研究发现［1，2］，在BLM诱导的肺纤维化形成过程，JAK/STAT1细胞因子信号传导途径参与了肺纤维化肺泡炎的形成，异常活化的STAT1诱导炎症细胞在肺内聚集、活化，产生大量的细胞因子和炎性介质，如肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-8等，刺激成纤维细胞增殖和胶原合成，从而参与肺纤维化的形成。
JAK/STAT1信号通路介导的细胞因子网络在肺纤维化形成过程中的作用机制目前尚不清楚，本研究通过观察BLM致肺纤维化大鼠肺组织中STAT1和PDGF表达的变化，探讨肺纤维化的可能发生机制。
1 材料与方法
1.1 模型复制与分组 雌性健康Wistar大鼠30只（泸州医学院实验动物中心提供，清洁级），平均体质量（200±20）g，随机分为两组，对照组（NS组）和模型7、14、28 d组（BLM7、14、28组），每组5只。用气管内注入博莱霉素法复制大鼠肺纤维化模型：用氯胺酮（100 mg/kg体重）腹腔注射麻醉大鼠，在无菌操作下作颈部正中切口，逐层暴露气管，BLM组用1 ml注射器（前带7号针头）抽取含BLM（5 mg/kg）的生理盐水0.2～0.3 ml，经两气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，将大鼠直立，继续朝向心端进针约1.0～1.5 cm，回抽无阻力，抽回空气，将药液注入气管，旋转动物，使药液在肺内分布充分、均匀。NS组在同样条件下，向气管内注入相同体积的生理盐水，于灌注后7、14、28 d随机处死动物各5只。处死大鼠后,立即分离气管及双肺,右肺用4 %多聚甲醛固定,制备石蜡包埋切片供常规组织学检查(HE染色)及免疫组化。
1.2 肺组织病理观察 常规石蜡包埋，切片，HE染色，镜下观察肺组织病理学改变。
1.3 支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞计数与分类 肺泡灌洗液1 500 r/min离心10 min，弃去上清液，收集细胞，计数。取10 μl细胞悬液充入细胞计数板，用低倍镜计数四角的四个大方格中的细胞数。沉淀细胞涂片，瑞氏染色后行细胞分类，选取100个白细胞，按其形态特点进行分类计数，求出各种白细胞所占的百分率，再以细胞总数求得BALF中各类白细胞的绝对值。
1.4 免疫组化方法检测肺组织STAT1和PDGF蛋白表达 一抗分别为兔抗鼠STAT1和PDGF多克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗兔IgG，操作按照试剂盒说明进行，阴性对照除了用PBS替代一抗外，所有步骤相同。以胞浆或胞核染色呈黄褐色或棕黄色沉着为阳性，其蛋白表达使用Leica Qwin图像分析系统进行半定量分析。
1.5 统计学处理 所有数据均采用SPSS13.0统计软件处理,各组数据用x±s表示，多个样本比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验，相关分析采用直线相关，以双侧α＝0.05为检验标准，P＜0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病理组织形态学改变 NS组各观察点均未出现明显病变。BLM组:第7天时肺泡内大量炎性细胞浸润，肺组织细胞水肿明显，可见成纤维细胞开始增多；第14天时肺泡炎症细胞减少,肺泡间隔增宽，成纤维细胞和基质明显增多；第28天肺纤维化程度加重，部分肺泡腔消失，为大量胶原纤维、成纤维细胞、淋巴细胞所占据，形成严重纤维化（见图1,2）。
2.2 BALF中细胞计数与分类 BLM组细胞总数在第7天达到高峰，第14天和28天开始下降，与NS组比较，均有统计学意义（P＜0.01）；中性粒细胞比例在第7天达高峰，第14天和28天开始下降，与NS组比较，均有统计学意义（P＜0.01），见表1。表1 各组大鼠BALF细胞成分的动态变化和分类注：与NS组比较，△P＜0.05
2.3 大鼠肺组织中STAT1和PDGF蛋白表达的动态变化 正常大鼠支气管黏膜上皮细胞未见STAT1表达，部分炎性细胞呈弱表达。BLM7天组STAT1染色明显加深，在炎性细胞中的表达明显增强，气道上皮细胞和肺泡上皮细胞普遍呈深染，与NS组比较，有显著差异（P＜0.01）；PDGF主要在肺泡巨噬细胞中表达，内皮细胞和中性粒细胞中也有表达，灌注BLM后第7天，BLM组肺组织中PDGF表达显著高于NS组（P＜0.01），随后下降，第28天时仍高于对照组（P＜0.05）。（见表3,图3、4、5）表3 各组大鼠肺组织STAT1和PDGF的表达注：与NS组比较，△P＜0.05，*P＜0.01
2.4 相关分析 分析组织中STAT1的蛋白表达与PDGF的蛋白表达、BALF中炎性细胞总数的关系后发现，组织中STAT1的蛋白表达与肺组织PDGF蛋白的表达、BALF中细胞总数呈正相关，其相关系数r值分别为0.880、0.892，P均＜0.01。肺组织PDGF蛋白的表达与BALF中细胞总数呈正相关，其相关系数r=0.902，P＜0.01。
3 讨论
肺纤维化是肺间质中过多的纤维蛋白沉淀导致肺紊乱的最终结果，这些细胞外基质蛋白的沉淀与细胞因子和生长因子，如TNF-α、IL-6、PDGF、转移生长因子-β1（TGF-β1）等水平的升高密切相关。有研究发现［1］，在BLM诱导的大鼠肺纤维化模型中，STAT1细胞因子信号传导途径参与了肺纤维化肺泡炎的形成，异常活化的STAT1通过上调AM及肺组织ICAM-1表达，诱导炎症细胞在肺内聚集、活化，参与肺纤维化的形成。本研究也发现在BLM诱导的肺纤维化大鼠肺组织中存在STAT1的异常活化，其表达水平在第7天达到高峰，第14天开始回降，但第28天时仍高于NS组（P＜0.01）而且与BALF中的炎性细胞总数和肺组织中PDGF的表达密切相关（r分别为0.892和0.880，P值均＜0.01），提示其可能参与了早期肺泡炎及随后肺纤维化的形成过程。
PDGF是重要的促纤维化因子之一，PDGF对巨噬细胞、中性粒细胞具有趋化作用，可刺激成纤维细胞增殖，增强纤维母细胞的转移、粘附，启动纤维化的过程；PDGF还可调节细胞外基质（ECM）的代谢，参与纤维化的发生［3,4］。本研究发现在BLM诱导的肺纤维化大鼠肺组织中存在PDGF的异常活化和过度表达，其表达主要在炎性细胞中，在内皮细胞和上皮细胞中也有表达，肺组织中PDGF表达在第7天达到高峰，第14天开始下降，第28天仍高于NS组（P均＜0.05），而且与BALF中的炎性细胞总数密切相关（r＝0.892，P＜0.01），提示PDGF可能参与了肺纤维化的形成过程。
因此我们推测JAK/STAT1信号通路在肺纤维化中的可能作用机制：活化的STAT1通过活化AM等炎性细胞后，分泌大量的PDGF，刺激平滑肌细胞、成纤维细胞增殖，使胶原合成增加，影响了ECM的代谢，从而参与了肺纤维化的形成过程。细胞因子网络在肺纤维化中的作用机制的不断探讨，将对肺纤维化的治疗提供重要的理论基础。
【参考文献】
［1］ FAN Xianming，WANG Zengli，LI Zhenhua .STAT1 activation and STAT1-dependent immune-response gene ICAM-1 expression in alveolar macrophages of rats suffered from interstitial pulmonary fibrosis［Ｊ］. Chin J Cell Mol Immunol，2003,19(1)：3-6.
［2］ 范贤明, 张世波, 刘春涛,等.STAT1反义寡核苷酸对肺纤维化大鼠肺泡巨噬细胞分泌TNF-α、IL-8和NO的影响［Ｊ］.细胞与分子免疫学杂志，2006, 22 (4)：487-492.
［3］ Lasky JA，Brody AR. Interstitial fibrosis and growth factors［J］. Environ Health Perspect，2000,108(Suppl4)：751-762.
［4］ Zhu YK，Liu XD，Rennard SI，et al. Synergistic neutrophil elastase-cytokine interaction degrades collagen in three-dimensional culture［J］. Am J Phy Lung Cell Mol Physiol，2001,281：868-878.
［5］ Laurent GJ，Cockerill P，Mcanulty RJ，et al.A simplified method for quantitation of the relative amounts of type and type collagen in small sample［J］. Anal Biochem，1981,113：301-312.
作者单位：滨州医学院药理学教研室 滨州市 256603