β淀粉样蛋白对小胶质细胞合成一氧化氮的影响

【摘要】  目的 探讨β淀粉样蛋白(amyloid betapeptide, Aβ)诱导小胶质细胞活化后κ轻链核因子(nuclear factorkappa B, NFκB)的表达及一氧化氮(NO)水平的变化。方法 Aβ干预纯化培养的小胶质细胞，观察其形态学变化，采用镉还原法测定NO水平，免疫细胞化学方法研究NFκB的表达。结果 500 nmol/L及1000 nmol/L Aβ干预组细胞形态呈“阿米巴样”，细胞核内NFκB的表达增加（P＜0.05），培养基中NO浓度升高（P＜0.05）。结论 Aβ激活小胶质细胞NFκB途径大量合成NO，可能参与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的致病过程。

【关键词】  β淀粉样蛋白 小胶质细胞 κ轻链核因子 一氧化氮 阿尔茨海默病

    Effect of amyloid betapeptide on activated microglial cell excreting nitric oxide

    HAN Xiaofeng  Lü  Li  GE Ruli  et al

    Department of Neurology, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603

    【Abstract】  Objective  To study the morphological changes of microglial cell activated by amyloid betapeptide, the expression of nuclear factorkappa B increased in nucleus and the levels of nitric oxide in cultural medium. Methods  Purified microglial cells were intervened by amyloid betapeptide and the morphological changes were observed . The cadmiumreduction method was used to determine the levels of nitric oxide in culture medium, immunocytochemical method to investigate changes of nuclear factorkappa B. Results  There were no statistical significant differences between the experimental group of 100 nmol/L amyloid betapeptide and the control group (P＞0.05). In the experimental groups of 500 nmol/L and 1000 nmol/L amyloid betapeptide, microglial cells were bigger, the expression of nuclear factorkappa B increased in nucleus and the levels of nitric oxide were higher in culture medium than control group (P＜0.05).Conclusion  The amyloid betapeptide could participate in the  processes of Alzheimer's disease by inducing microglial cells to excrete nitric oxide.

    【Key words】  amyloid betapeptide，microglial cell，nuclear factorkappa B，nitric oxide，Alzheimer's disease

    阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)重要的病理特征之一是纤维状β淀粉样蛋白(amyloid betapeptide, Aβ)在神经细胞外及脑血管壁沉积形成老年斑(senile plaques, SP)。大量研究表明，Aβ的沉积在AD发病中起着关键作用，但其神经损伤的具体机制尚不完全清楚，研究提示，一氧化氮(nitric oxide, NO)可能与Aβ的神经毒性有关。本研究用Aβ干预小胶质细胞，观测κ轻链核因子(nuclear factorkappa B, NFκB)的表达以及NO水平的变化，探讨Aβ诱导小胶质细胞合成NO的机制。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物：出生3 d内的Wistar大鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

    1.1.2  试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清（购自Hyclone公司），Aβ140、Aβ142（购自SIGMA公司），胰蛋白酶、TritonX100（购自Amresco公司），小鼠抗大鼠CD11b单克隆抗体（购自Serotec公司），兔抗NFκB p65 多克隆抗体（购自SANTA CRUZ公司），抗小鼠及抗兔SP试剂盒和DAB显色试剂盒（均购自北京中山生物技术有限公司）。

    1.2  方法

    1.2.1  小胶质细胞分离、培养：在无菌条件下取出新生Wistar大鼠的大脑，剥离脑膜，取大脑皮层，剪成0.5 mm3碎块，加入1 ml 0.125%胰蛋白酶室温消化，用100目不锈钢筛网过滤，离心，弃上清，加入DMEM/F12培养基重新悬浮细胞，接种于多聚赖氨酸包被的50 ml培养瓶中，置于37℃、含5%CO2、20%O2饱和湿度的培养箱中培养。原代混合胶质细胞培养7～9 d后，在37℃恒温摇床上以250 r/min振速摇动处理2.5 h，将细胞悬液接种到已放置盖玻片的培养皿中，37℃培养1 h，弃未贴壁细胞，加新鲜培养基，培养5～7 d即可使用。用免疫细胞化学方法标记其特异性抗原CD11 b进行细胞纯度鉴定，小胶质细胞比例占90%以上即符合要求。

    1.2.2  Aβ的“老化（aged）”：用无菌三蒸水将Ａβ稀释成 0.5×105 nmol/L，37℃孵育 1周，使其变为聚集状态的Ａβ［１］。

    1.2.3  小胶质细胞的干预：培养皿中分别加入不同浓度的“老化”Ａβ140或Ａβ142，对照组则不加Ａβ，继续培养24 h。收集培养基，-80℃保存，备测定NO浓度。细胞爬片用甲醛固定15 min，-20℃保存备用。

    1.2.4  免疫细胞化学染色：免疫细胞化学染色采用SP法。第一抗体小鼠抗大鼠CD11b单克隆抗体的稀释度为1∶1 000，兔抗NFκB p65 多克隆抗体的稀释度为1∶200，以PBS替代一抗作阴性对照。联苯二胺（DAB）显色。NFκB p65免疫细胞化学结果判断：在高倍视野下行细胞计数，细胞核有棕褐色颗粒着色为阳性，无棕褐色颗粒着色为阴性。并根据Handel等［2］的分级标准半定量：-(＜5% )，+(5%～25% )，++(26%～ 49% )，+++ (≥ 50 % )。

    1.2.5  NO测定：采用Cortas NK等［3］的镉还原法测定NO浓度。用不同浓度的KNO3做阳性标准管，无标本管做空白对照。用721分光光度计测定OD值。计算标准曲线并换算NO浓度。

    1.2.6  统计学处理：数据资料应用SAS 6.12版软件进行统计学分析。等级计分结果比较采用Ridit分析。计量数据以均数±标准差（x±s）表示，统计分析采用多个均数之间两两比较的SNK检验。

    2  结果

    2.1  小胶质细胞鉴定及Aβ干预后其形态学变化  经CD11b免疫细胞化学染色，胞膜及胞浆染色的细胞即为小胶质细胞，其纯度达92%(图1A，1B)。正常培养的小胶质细胞的形态特征为：胞体小，呈椭圆形或三角形，具有伸向各个方向的细小突起 (图1A)。Aβ干预后小胶质细胞胞体变大，形态不规则。部分细胞有片状突起或伪足，呈“阿米巴样”(图1B)。

    ( → )所标记为小胶质细胞

    图1A  正常培养的小胶质细胞CD11b免疫

    细胞化学反应及其形态(×400)图1B   Aβ干预后小胶质细胞CD11b免疫

    细胞化学反应及其形态(×400)

    2.2  Aβ干预后NFκB的表达变化  NFκB免疫细胞化学染色后，对照组细胞胞浆染色，而Aβ干预组细胞除胞浆外，胞核及核周区域亦出现染色(图2A，2B)。等级计分Ridit分析，Aβ142 和Aβ140 500 nmol/L干预组与对照组比较差异有显著意义 (P＜0.05)，1 000 nmol/L组与对照组比较差异有极显著意义 (P＜0.01)，而100 nmol/L组与对照组比较差异无显著性(P＞0.05)(表1)。相应浓度的Aβ142干预组与Aβ140干预组比较差异无显著性 (P＞0.05)。

    图2A  对照组小胶质细胞NFκB p65免疫

    组化反应(×400) 图2B  1 000 nmol/L Aβ42干预后小胶质细胞

    NFκB p65免疫组化反应(×400)  表1  NFκB p65免疫细胞化学结果及Ridit分析

    2.3  Aβ干预后培养基中NO含量变化  100 nmol/L Aβ140、500 nmol/L Aβ140、100 nmol/L Aβ142干预组培养基中的NO含量与对照组比较无显著差异(P＞0.05)；500 nmol/L Aβ142、1 000 nmol/L Aβ140干预组培养基中的NO含量与对照组比较显著增高(P＜0.05)；1 000 nmol/L Aβ142干预组培养基中的NO含量增高与对照组比较有极显著意义 (P＜0.01) (表2)。相应浓度的Aβ142干预组与Aβ140干预组比较无显著差异(P＞0.05)。表2  Aβ干预后培养基中的NO含量比较

    3  讨论

    研究证明，NO参与了AD的病理过程并发挥重要的作用［4］，但Aβ诱导合成NO的具体机制尚未完全阐明，Guo等［5］报道其与NFκB的信号转导和基因转录密切相关。

    本实验结果显示， Aβ干预小胶质细胞后，核内NFκB的表达增加，提示NFκB被激活。NFκB是普遍存在于细胞浆中的一种快反应转录因子，调控细胞因子、趋化因子、免疫受体、转录因子、氧化应激相关酶以及急性期蛋白等多种靶基因，参与炎症和免疫反应、细胞周期控制与分化、细胞凋亡、感染及应激反应，其在AD的发病机制中具有重要的作用［6］。静息状态下，NFκB与NFκB抑制蛋白（IκB）单体结合，以非活性状态存在于胞浆中。在外界因素的作用下，IκB 快速降解，有p50和p65两个亚单位组成活化状态的NFκB迅速转移入胞核，与靶基因的κB序列结合启动基因转录。

    目前认为，小胶质细胞表面有多种Aβ结合的受体：清道夫受体(class A scavenger receptor, SR)、晚期糖化终末产物受体(receptor for advanced glycation endproducts, RAGE)及甲酰基蛋白受体（formyl peptide receptorlike 1，FPRL1）等，Aβ与受体结合后启动第二信使激活NFκB途径［7～9］，而NFκB如何被激活尚不清楚。

    可诱导的一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)基因是NFκB调控的一个重要靶基因，被Aβ激活的NFκB转移入核，结合于iNOS的启动子区的NFκB反应元件，诱导iNOS大量的表达，NO产生增多［10］。此与本实验结果一致，低浓度(500～1 000 nmol/L)Aβ可激活小胶质细胞致NO产生增多。

    NO在中枢神经系统的神经传导、记忆和空触可塑性中发挥重要的生理功能，而过量的NO可通过多种途径损伤膜性结构、蛋白质及DNA，导致神经元坏死或凋亡［11］；亦可介导和放大氧化应激、炎症级联反应，进而选择性损害与学习记忆有关的神经元，促进SP的形成［12］，使AD病理变化进行性发展。可以推论，Aβ的神经毒性机制之一是通过激活NFκB诱导iNOS过表达而产生超生理剂量的NO来发挥的。

    因此，小胶质细胞的AβNFκBiNOSNO途径，可能在AD过程中起着重要的作用，对此途径进行深入研究，可进一步揭示AD发病机制以及为AD的临床治疗提供理论依据。

【参考文献】
  ［１］ Giovannelli L, Casamenti F, Scali C,et al. Differential effects of amyloid peptides β(140) and β(2535) injections into the rat nucleus basalis［J］. Neurosci, 1995, 66(4): 781792.

［2］ Handel ML, McMorrow LB, Gravallese EM. Nuclear factorκB in rheumatoid synovium. Localization of p50 and p65［J］. Arthritis Rheum，1995, 38(12): 17621770.

［3］ Cortas NK, Wakid NW. Determination of inorganic nitrate in serum and urine by a kinetic cadmiumreduction method［J］. Clin Chem, 1990, 36(8 Pt 1): 1440443.

［4］ Combs CK, Karlo JC, Kao SC, and Landreth GE. βAmyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNFαdependent expression of inducible nitric oxide synthase and neuronal apoptosis［J］. J Neurosci, 2001, 21(4): 11791188.

［5］ Guo Q, Robinson N, Mattson MP,et al. Secretedβamyloid precursor protein counteracts the proapoptotic action of mutant presenilin1 by activation of NFκB and stabilization of calcium homeostasis［J］. J Biol Chem, 1998, 273(20): 1234112351.

［6］ 任会荣，钱令嘉. β淀粉样蛋白、核因子κB与阿尔茨海默病［J］. 国外医学: 老年医学分册, 2001, 22(5): 223226.

［7］ Meda L, Cassatella MA, Szendrei GI,et al. Activation of microglial cells byβamyloid protein and interferongamma［J］. Nature, 1995, 374(6523): 647650.

［8］ Giulian D, Haverkamp LJ, Li J,et al. Senile plaques stimulate microglia to release a neurotoxin found in Alzheimer brain［J］. Neurochem Int, 1995, 27(1): 119137.

作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科