离体动物细胞对病原菌的免疫防御作用

【摘要】  目的 利用诱导的离体动物细胞系兔肾细胞RＫ13 和昆虫细胞Tn5B1产生抗菌活性肽类物质，筛选具有抑菌作用的抗菌药物。方法 利用热灭活的大肠杆菌DH5α或柠檬色葡萄球菌分别诱导RＫ13和Tn5B1，对16 h后的细胞诱导产物应用滤纸片法和双层平板法做抑菌活性检测。结果 诱导的细胞系随着诱导时间延长出现了一系列形态变化。诱导产物均对受测细菌金黄色葡萄球菌形成了较明显的抑菌圈，且热灭活的大肠杆菌DH5α诱导RＫ13的诱导产物较之后者的抑菌圈更明显。结论 RＫ13和Tn5B1经热灭活的大肠杆菌和柠檬色葡萄球菌分别诱导后分泌了具有抗菌活性的物质。

【关键词】  离体细胞 诱导 抗菌肽 免疫防御

    Immune defense to pathogen using cultured animal cells

    QIAO Yuanyuan1  CAO Weiyou1  MI Wei1  et al

    1 Teaching and Research Section of Pathogenic Biology, Binzhou Medical University,Binzhou 256603；2 Clinical Teaching

    Section of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine；3 Key Laboratory of Pesticide & Chemical Biology

    Huazhong Normal University, Ministry of Education Huazhong Normal University

    【Abstract】  Objective  Cultured RＫ13 and Tn5B1 animal cell lines were induced with heatkilled Esherichia coli DH5α or Staphylococcus sarophyticus.Methods  Analysis by bacterial growth inhibition experiments and twolayer plate method indicated that they  generated obvious inhibition zones compare to control.Results  Morphological change was displayed on cell lines induced.Staphylococcus aureas to be detected were susceptible to the antimicrobial substance from inducible animal cells in culture.In comparison, the antimicrobial substance induced with heatkilled Esherichia coli DH5α displayed more obvious inhibition zones.Conclusion  Antibacterial substances were produced and secreted into media from induced animal cell lines.

    【 Key words】  cell lines, induction, antimicrobial peptide, immune defense

    研究发现，从低等的细菌、线虫、水生生物、昆虫、蛙到哺乳动物以及人类细胞都能产生抗菌肽［1，2］。抗菌肽作为阳离子型小分子多肽，具有广谱抗菌活性，在机体的天然免疫中起着关键的调节作用［3］，并且作为辅助因子，与其他的免疫效应物一起可加快伤口愈合、消除炎症、控制感染［4］。

    细菌的耐药性出现在20世纪50年代，这给临床药物治疗带来了困难。许多研究致力于发现新的抗菌药物。抗菌肽是生命体天然免疫系统中的小分子多肽，是免疫防御中的重要物质，具有抗细菌、真菌、寄生虫、病毒，杀害肿瘤细胞的功能，是新型抗菌药物的理想选择［5］。从水生动物体内分离到杀锥虫以及利什曼原虫的抗菌活性肽，蛙皮肤上分离到抗幽门螺杆菌的抗菌肽、橘柑树上抗青霉菌的富含色氨酸的活性肽等［2，6］。研究表明，抗菌活性物质不仅可以从生物机体中获得，也已经从多种离体细胞诱导分离得到［7］。我们实验室利用灭活的大肠杆菌以及柠檬色葡萄球菌诱导离体哺乳动物细胞及昆虫细胞产生了抗菌活性物质——抗菌肽。

    1  材料与方法

    1．1  材料  供试细胞系及菌株：粉纹夜蛾Tn5B1细胞由武汉大学提供，兔肾动物细胞RK13由华中师范大学提供；大肠杆菌DH5α、柠檬色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌均系本实验室保存菌株。

    1．2  方法

    1.1  哺乳动物细胞及昆虫细胞培养

    1.1.1  兔肾细胞RK13培养：兔肾细胞系RK13利用辅加10%小牛血清的1640培养基于37℃、5%CO2的培养箱中传代培养,每天观察细胞贴壁生长情况,每两天换液并传代,扩大培养以备诱导所用。

    1.1.2  Tn5B1细胞的培养：在液氮冻存的Tn5B1细胞按常规方法复苏，复苏后的细胞用辅加20%胎牛血清的Grace培养基培养，细胞生长状态恢复正常后换用补加10%胎牛血清的Grace培养基常规培养，以备诱导。

    1.2  细菌的培养

    1.2.1  大肠杆菌培养与制备：将DH5α接种于LB培养基中，37 ℃、150 r/min恒温摇床培养过夜，离心取沉淀，121 ℃、20 min灭活备用。

    1.2.2  柠檬色葡萄球菌收集与制备：将活化的柠檬色葡萄球菌划线接种于普通琼脂平板上，37℃恒温箱中培养，收集细菌，80 ℃、30 min灭活备用。

    1.3  抗菌肽的诱导

    1.3.1  兔肾动物细胞抗菌活性物质的诱导：将灭活的大肠杆菌和柠檬色葡萄球菌分别与1640培养基混合（按照过量诱导菌比例），加入PBS漂洗过的兔肾动物细胞RK13的培养瓶中诱导16 h后收集，2000 r/min、10 min离心弃去细菌和细胞等取上清。对此上清进行三氯乙酸冰浴沉淀10 min后8000 r/min、10 min离心取沉淀，丙酮洗后14 000 r/min、15 min离心两次，分离出的沉淀物质为待检测的抗菌物质，于-20℃冰箱保存备用，对照组不加细菌，对细胞作同样处理。

    1.3.2  昆虫细胞抗菌肽的诱导：传代培养的Tn5B1细胞经PBS洗两次后如上述处理，不同在于用Grace基础培养基培养16 h后收集上清，离心后进行有机溶剂沉淀收集备用［14］。

    1.4  抗菌活性的检测

    1.4.1 滤纸片法：取抗菌活性物质分别对大肠杆菌DH5α、柠檬色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌进行抑菌活性检测，接种10 μl活化菌株后涂布平板，然后将加有样品的圆滤纸片轻放于平皿上，37 ℃恒温培养箱过夜，并用灭活的对应细菌作对照试验。

    1.4.2  双层平板法：将活化的葡萄球菌加入冷却至70℃的半固体培养基中混匀，迅速倾入已倒好的平板上，待半固体培养基形成后，将加有不同浓度样品的圆滤纸片轻放其上，37 ℃恒温培养箱过夜，灭活的对应细菌作对照试验。

    2  结果

    2.1  诱导前后细胞生长状况观察  诱导前：细胞生长状态较好，镜下细胞饱满、透亮，呈梭形或圆形，细胞间隙较小，贴壁生长（如图1）。诱导后：诱导后细胞生长较慢，但是12 h后细胞生长较快，细胞间隙变小，镜下细胞生长状态正常（如图2）；但是随着诱导时间延长，镜下细胞变得小不再饱满，且细胞间隙增大，多见细胞聚集成团，培养液中有细胞漂浮（如图3）。

    图1  诱导前的兔肾细胞图2  诱导12 h后的兔肾细胞  图3  诱导24 h后的兔肾细胞   

    2.2  抗菌活性  抑菌试验显示，诱导的兔肾细胞系RK13经过热灭活的不同病原菌诱导，产生了抗菌活性物质，其中大肠杆菌诱导RK13以及柠檬色葡萄球菌诱导RK13产生的抗菌物质对金黄色葡萄球菌都有抑菌活性，相比之下前者抑菌作用更强，而诱导的抗菌产物对金黄色葡萄球菌作用效果强于柠檬色葡萄球菌。而同时进行的氨苄青霉素对金黄色葡萄球菌的药敏试验没有出现抑菌圈（见表1）。图4示热灭活大肠杆菌诱导兔肾细胞所得诱导物质进行抑菌试验的结果，可清楚的显示，培养的兔肾细胞RK13，经过DH5α诱导后上清产生了抗金黄色葡萄球菌的活性物质。表1  两种灭活菌分别诱导兔肾细胞RK13后对不同菌株的抑菌情况菌

    3  讨论

    对培养的正常动物细胞及诱导的动物细胞进行形态学观察，发现RK13经诱导后细胞变圆，生长缓慢，细胞暂时出现生长迟缓期，此时细胞被诱导源所攻击，细胞正逐步适应有病原菌的生长环境，但是随着诱导时间的延长，12 h后诱导的细胞生长较快，与正常培养条件下同样生长的细胞比较，且生长状况较好，这时的细胞为了生存，本身受刺激产生了抗菌活性物质，说明诱导后的细胞产生了抗菌物质，在诱导12 h、16 h细胞瓶底贴满呈规则梭形的细胞，细胞已经产生了足够量的对付外界病原菌的抗菌物质，随着产生的抗菌物质增多，细胞开始适应有病原菌的环境，生长状态逐渐正常化。随着诱导时间的继续延长，细胞之间出现接触抑制，24 h细胞出现结团，最后漂浮死亡。

    我们利用诱导的兔肾细胞系RK13细胞，收集上清浓缩蛋白，获得了较高含量的抗菌蛋白肽类物质。对于Tn5B1昆虫细胞诱导前后的细胞生长也发生了类似的变化过程，由于目前对昆虫抗菌肽的研究较多，关于粉蚊夜蛾离体细胞诱导抗菌肽的试验，洪华珠等［8］的研究中，也有了很好的说明，在此我们将其用于对比试验。此RK13细胞诱导产生的抗菌物质与诱导Tn5B1细胞产生的抗菌肽是否不同，有待进行对比研究。我们还试图寻找此类抗菌肽与抗生素的异同，抑菌试验显示，诱导RK13细胞获得的抗菌肽能够抑制金黄色葡萄球菌和柠檬色葡萄球菌的生长，而受测的金黄色葡萄球菌对氨苄青霉素不敏感。近半个世纪以来，随着抗生素的大量使用，很多病原菌对抗生素产生了耐药性，特别是金黄色葡萄球菌，对多种抗生素都有较强的耐药性，初步试验显示，诱导兔肾细胞RK13产生的抗菌物质对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，这对人类解决临床上许多由金黄色葡萄球菌引起的疾病有重大意义，为人类寻找新的抗生素替代品提供了可能。但是，把这种抗菌肽作为药物应用于临床还有很多问题需要解决，还需要进一步的试验研究。

【参考文献】
  ［1］ 　Chen L, Li Y, Li J,et al.An antimicrobial peptide with antimicrobial activity against Helicobacter pylori［J］.Peptides,2007,28(8):15271531.

［2］　Bradshaw J.Cationic antimicrobial peptides : issues for potential clinical use［J］.BioDrugs,2003,17(4):233240.

［3］　Boman HG.Comment in: Antibacterial peptides: basic facts and emerging concepts［J］.J Intern Med,2004,255(4):519520.

［4］ Brown KL, Hancock RE. Cationic host defense antimicrobial peptides［J］. Curr Opin Immunol,2006,18(1):2430.

［5］　Rossi LM, Rangasamy P, Zhang J,et al.Research advances in the development of peptide antibiotics［J］.J Pharm Sci,2008,97(3):10601070.

［6］ Munoz A, LópezGarcía B, Marcos JF. Comparative Study of Antimicrobial Peptides to Control Citrus Postharvest Decay Caused by Penicillium digitatum［J］.J Agric Food Chem,2007,55(20):81708176.

［7］ Fallon ΑM, Sun X. Exploration of mosquito immunity using cell in culture［J］. Insect Biochem Mol Bio,2001,31:263278.

［8］ 洪华珠,Fallon AM.粉纹夜蛾离体细胞抗菌肽的诱导和抗菌活性测定［J］.华中师范大学学报,1999,33(4):564569.

作者单位：1滨州医学院病原生物学教研室 滨州市 256603；2 滨州医学院中西医结合临床教研室；