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【摘要】 目的 探讨前列腺癌（PCa）中血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）的表达和微血管密度(MVD)的关系及意义。方法 采用免疫组织化学技术检测50例PCa组织及19例前列腺增生（BPH）组织中AT1R的表达及MVD。结果 AT1R在PCa组织和BPH组织表达差异有显著性（P＜0.01）；AT1R在PCa不同组织分化组间、不同临床分期间差异有显著性（P＜0.05），其阳性表达率随分化程度的降低、临床分期的增高而增高。PCa组织中MVD明显高于BPH组织（P＜0.01），随组织分化程度的降低、临床分期的增高而增高(分别为P＜0.01,P＜0.05)；PCa组织中AT1R表达阳性者MVD明显升高（P＜0.05），两者存在正相关关系（r=0.647）。结论 AT1R高表达和微血管形成在PCa的发生、发展中起重要作用，且两者密切相关；联合检测AT1R及MVD对判断PCa的恶性程度及预后可能具有重要的临床意义；特异性阻断AT1R可能是治疗PCa的一种新方法。
【关键词】 前列腺癌；血管紧张素Ⅱ1型受体；微血管密度；免疫组织化学
Study of relationship between angiotensin Ⅱ type 1 receptor expression and microvessel density in prostate carcinoma
CHE Zi SUN Lijiang WANG Jianwei et al
Department of Urology, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003
【Abstract】 Objective To explore the relationship and the significance between the expression of angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT1R) and microvessel density (MVD) in prostate carcinoma (PCa). Methods Immunohistochemical method was used to study AT1R and MVD in tissue samples of 50 cases of prostate carcinoma and 20 cases of benign prostatic hyperplasia (BPH).Results There was a significant difference in AT1R expression between PCa and BPH (P＜0.05),and there was a significant difference in MVD between PCa and BPH (P＜0.01). The positive rate of AT1R and MVD is associated with differentiated degrees and clinical stages in PCa .MVD in AT1R positive group was significantly higher than that in AT1R negative (P＜0.05).There was a positive correlation between AT1R expression and MVD (r=0.647).Conclusions The high expression of AT1R is correlated with the formation of microvessel,they play important roles in development of PCa.AT1R and MVD examination is useful for the judgment of malignant degree and prognosis.The specific blockade of AT1R might be a noteworthy anticancer therapeutic option in prostate carcinoma.
【Key words】 prostate carcinoma，angiotensin Ⅱ type 1 receptor，microvessel density，immunohistochemistry
血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,AngⅡ)是肾素血管紧张素系统最重要的活性肽，在调节血压和电解质平衡上起重要作用。血管紧张素Ⅱ1型受体（angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1R)被认为AngⅡ引起细胞增殖、血管生成的最为重要的一类受体。近年来，AT1R与肿瘤的关系特别是与肿瘤血管生成的关系引起了人们的重视，并且做了大量研究工作，主要集中在人胰腺癌和乳腺癌方面，而关于AT1R在前列腺癌中的表达情况及意义，国内外相关报道较少。因此研究AT1R在前列腺癌（prostate carcinoma,PCa）中的表达情况及其与肿瘤微血管形成的关系，可能对进一步阐述前列腺癌的生物学行为提供依据。本实验采用免疫组织化学技术检测PCa组织中的AT1R表达和MVD，探讨PCa组织中AT1R的表达及其与微血管生成的相关性及意义。
1 材料与方法
1.1 标本来源 实验组石蜡包埋标本取自青岛大学医学院附属医院2000—2008年住院手术并有完整临床资料的50例PCa患者，年龄53～83岁，平均68岁，术前均未接受过放化疗及内分泌治疗。按Gleason（1992年）修定的分级和评分标准,将50例前列腺癌分为高分化组（2～4分）13例、中分化组（5、6分）17例、低分化及未分化组（7～10分）20例。按JewettWhitmoreProut(JWP)分期将实验组分为：A+B期28例,C+D期22例。对照组石蜡标本取自青岛大学医学院附属医院2005—2008年收治的良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia,BPH）患者，共19例，术前未用保列治等5α还原酶抑制剂及抗炎药物。标本均做4 μm厚的连续组织切片。
1.2 试剂 兔抗人AT1R多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，鼠抗人CD34单克隆抗体、PV9000试剂盒以及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司。
1.3 方法 采用免疫组化PV二步法，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。石蜡切片脱蜡至水，体积分数3%过氧化氢室温孵育10 min，以微波枸橼酸盐进行抗原修复，正常羊血清封闭20 min，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片，中性树胶封固。每组实验均设有阳性对照和阴性对照，阳性对照以试剂盒自带的免疫组化染色结果为标准，阴性对照以PBS替代一抗的免疫组化染色结果为标准。
1.4 结果判定 AT1R在PCa细胞中阳性表达为胞膜和/或胞浆着色，染色阳性信号呈棕色或棕黄色颗粒。依据阳性细胞数的比例确定阳性反应强度：每张切片随机观察10个高倍视野，至少计数300个癌细胞，计算其中阳性细胞的比例，＜5%为阴性（-）、5%～10%为弱阳性（+）、11%～40%为中等阳性（++）和＞40%为强阳性（+++）表达。
CD34阳性定位于细胞质,呈棕黄色。微血管判断及MVD计数参照文献［1］：凡在肿瘤组织中与邻近微血管、肿瘤细胞及其他组织分界清楚的任何一个染成棕黄色的细胞或细胞丛，均被认为是一个新生肿瘤血管，只要结构不相连，其分枝结构也作为一个血管计数，凡管腔大于8个内皮细胞直径或肌层较厚者不列入记数；切片先置于100倍光学显微镜下确定最高血管密度区域，然后置于200倍光学显微镜下，选择5个最高血管密度区域记数，分别取5个区域进行血管计数，然后求平均值作为该病例的MVD。
1.5 统计学方法 应用SPSS11.5统计学软件进行数据处理,数据间比较采用χ2检验、t检验，相关性分析采用Spearman秩等级相关分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 AT1R的表达及临床病理特征 AT1R阳性染色主要定位于胞浆和/或胞膜上，为棕色或棕黄色颗粒。50例PCa组织中有36例AT1R为阳性表达（72%），而在19例BPH组织中只有5例AT1R为阳性表达（26.32%），两者有极显著性差异（χ2=11.917，P＜0.01）, PCa患者中AT1R的阳性表达率随着病理分化程度的降低、临床分期的增高，呈逐渐上升的趋势（分别为χ2= 7.539，P＜0.05；χ2=4.020，P＜0.05）,见表1。
2.2 MVD的表达及临床病理特征 MVD在PCa组织中的值为49.47±10.17，在BPH组织中的值为16.95±5.13，PCa组织中的MVD要明显高于在BPH组织中的MVD（t=17.498，P＜0.01）。PCa组织中高分化组与中分化组间、中分化组与低分化组间以及高分化组与低分化组间的MVD差异均有显著性（分别为t=3.670，P＜0.01；t=3.492，P＜0.01；t=3.812，P＜0.01），且在浸润性肿瘤（C+D期）与局限性肿瘤（A+B期）的差异有显著性（t=2.579，P＜0.05），PCa患者中MVD随着病理分化程度的降低、临床分期的增高，呈逐渐上升趋势, 见表1。表1 前列腺增生及前列腺癌组织中AT1R表达、MVD的比较
2.3 前列腺癌组织中AT1R的表达与MVD的关系 AT1R阳性表达的PCa组织中MVD为51.79±7.26，AT1R阴性表达的PCa组织中MVD为30.61±2.83，前者明显高于后者（t=2.579，P＜0.05）。经Spearman相关分析显示，PCa组织中，AT1R表达与MVD成正相关（r=0.647，P＜0.01）。
3 讨论
AngII是肾素血管紧张素系统的主要生物活性肽, AngⅡ作为一个重要的应激激素和多效应生长因子对肿瘤的影响日益受到关注，它通过与AT1R和AT2R两种受体亚型的结合发挥生物学作用。其中，AT1R广泛分布于所有的组织器官，AT2R广泛分布于胚胎组织，在出生后其表达迅速减少。AT1R介导了AngII的绝大部分作用，包括平滑肌收缩、醛固酮分泌、体液调节以及细胞生长增殖。
最近发现AT1R在多种肿瘤组织中表达, 这其中包括脑肿瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌和子宫颈癌等。AT1R在皮肤鳞癌中过表达并和肿瘤分化状态有关［2］，在人头颈部和卵巢癌AT1R过表达并和肿瘤浸润相关［3，4］。Uemura等［5］RTPCR检测发现,在前列腺癌癌组织中AT1RmRNA表达水平较正常前列腺组织升高。本研究结果显示，AT1R在PCa组织中的阳性表达率为72%，与其在前列腺增生组织中的表达差异具有显著性；组织分化程度愈低、临床分期愈晚，AT1R的阳性表达率愈高，浸润性肿瘤（C+D期）中的表达明显高于局限性肿瘤（A+B期），以上结果表明AT1R的表达参与了PCa的发生和发展。前列腺癌组织分化程度和临床分期与病人预后密切相关。我们推测，AT1R表达的阳性的前列腺癌具有更强的转移倾向，AT1R表达可以作为判断前列腺癌预后的一个重要指标，AT1R在前列腺癌细胞分化及演进的过程中可能起重要作用。
实体肿瘤的生长具有典型的血管依赖性，当肿瘤生长到数毫米时，若无新血管形成，肿瘤细胞将保持休眠状态或发生退化。对肿瘤血管生成进行定量分析有许多生物方法, 但大多不能得到可靠的结果, 但是针对血管内皮细胞抗原的免疫组化技术, 使肿瘤血管的定量较为可靠, 被认为是能反映肿瘤血管生成的一个指标，反映肿瘤血管生成的指标MVD与实体瘤的组织分化、临床分期及预后密切相关［6］。本研究采用能显示血管内皮细胞的CD34标记肿瘤内微血管，定量测定PCa和BPH组织中MVD，发现PCa组织中MVD显著高于BPH组织，并且MVD随组织分化程度的降低和临床分期的升高而增高，表明了PCa生长依赖于新生血管的形成，癌组织中微血管增加为肿瘤细胞提供充分的氧气和营养，新生血管的内皮细胞表达多种生长因子，刺激肿瘤细胞增殖。本研究结果还显示，浸润性前列腺癌（C+D期）MVD显著高于局限性前列腺癌（A+B期），可能由于肿瘤血管缺乏周细胞,基底膜不完整,肿瘤细胞易于进入血液循环。这与国内外报道［7，8］的2年内死亡者PCa中MVD明显高于存活2年以上者一致，说明MVD与PCa患者预后关系密切,肿瘤组织中MVD越高，进入循环的瘤细胞数相对越多，MVD表达可反映PCa恶性程度。微血管的形成同PCa组织的发生、浸润和转移密切相关，MVD可作为判断PCa患者病情及预后的指标之一。
最近动物模型研究表明, AT1R阳性表达与肿瘤微血管的形成密切相关，可能促进肿瘤微血管的形成，其拮抗药如氯沙坦、坎地沙坦等可抑制实验动物体内相关肿瘤的生长和减少血管生成［9］。通过阻断AT1R而抑制肿瘤生长和血管生成将来可能会成为一种行之有效的抗癌策略，检测AT1R在肿瘤内皮细胞中的表达情况可能会弄清其在肿瘤血管生成中所起的作用。目前认为在肿瘤的发生发展过程中，AT1R可能通过以下两种机制增加内皮细胞迁移和血管形成：一方面，AT1R可通过促进内皮细胞以旁分泌方式上调VEGF水平来促血管生成，还能增加内皮细胞中VEGF2受体（VEGFR2)和AngⅡ的表达。在微血管内皮细胞中，AT1R可激活EGFR，从而上调VEGF和AngⅡ的表达。另一方面，AT1R还能通过激活磷酸肌醇3激酶Akt通路（PI3KAkt）上调survivin和抑制半胱天冬酶3的活性,从而具有抗凋亡作用［10］。本实验结果显示，PCa组织中AT1R阳性组与AT1R阴性组间MVD值存在显著性差异，且AT1R与MVD值之间存在正相关。提示AT1R在PCa中有诱导血管生成作用，通过上调MVD在PCa的发生发展中起到重要作用，阻断PCa中的AT1R的产生可能会降低PCa微血管的形成。鉴于AT1R介导了AngⅡ的促生长抗凋亡作用, 动物实验也已证实AT1R阻断剂抑制了肿瘤的生长和与肿瘤生长密切相关的血管再生，提示AngⅡ可能通过肿瘤组织中上调的AT1R参与肿瘤的生长，抑制AngⅡ的产生或阻滞AT1R可能对肿瘤的生长产生抑制作用, 本研究结果可能对PCa的治疗提供新的方法。
本研究初步表明，AT1R高表达和微血管形成与PCa临床病理特征密切相关，且AT1R在前列腺癌中的表达与MVD密切相关，可能是通过促进肿瘤血管形成的途径产生作用，联合检测AT1R及MVD对判断PCa的恶性程度、侵袭能力及预后可能具有重要的临床意义；特异性阻断AT1R与AngⅡ结合能有效抑制PCa的生长和血管生成，为PCa的治疗提供了一种新的尝试方向。
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作者单位：青岛大学医学院附属医院泌尿外科 青岛市 266003;2 广饶县人民医院泌尿外科