整合素β1在体外培养牛眼小梁细胞中的表达

【摘要】  目的 探讨体外培养小梁细胞表面整合素表达及其意义。方法 对牛眼小梁细胞进行原代及传代培养，并行鉴定。对传三代的牛眼小梁细胞施加整合素β1一抗，后分别给予荧光和多聚辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，并将细胞置于荧光倒置显微镜下观察摄像。结果 应用免疫荧光和免疫酶技术方法均可观察到培养小梁细胞表面整合素β1阳性染色。结论 体外培养的牛眼小梁细胞表达整合素β1，为以后研究原发性开角型青光眼病因学提供良好实验基础。

【关键词】  牛眼小梁细胞；整合素；细胞外基质；青光眼

Expression of integrinβ1 in cultured bovine trabecular meshwork cells

    ZHANG Qiang  ZHAO Yan  LI Yan  et al

    Dapartment of Ophthalmology,Binzhou Medical University,Binzhou  256603

    【Abstract】  Objective  To study the expression and significance of integrinβ1 in cultured bovine trabecular meshwork(BTM)  cells  Methods  BTM cells were primarily cultured and subcultured, and rendered identification. The third generation BTM cells were rendered rabbit AntiIntegrin β1, stained with antiintegrinβ1 by FITCIgG and HRPIgG.The BTM cells was observed by inverted microscope, and taked pictures.Results  Making use of immunofluorescence  and immunohistochemistry, we observed positive staining of integrinβ1 in cultured 　BIM　 cells.Conclusion  Cultured bovine trabecular meshwork cells express integrinβ1，and can be used as good experimental base for researching etiology of POAG in the future.

    【Key words】  trabecular meshwork,integrin,extracellular matrix;glaucoma

    整合素（integrin）是一类细胞膜表面的糖蛋白受体家族分子, 在人体各种组织中表达, 它介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)之间的反应, 参与细胞信号传递、细胞黏附、迁移, 控制细胞分化、增殖以及凋亡等各种生理过程。人眼房水外流阻力主要存在于小梁网组织, 小梁网内环境的稳定是保持房水外流通畅、维持正常眼内压的关键因素。随着分子生物学等相关学科的发展, 人们观察到小梁网表达多种整合素亚单位, 并对其之间的关系进行了深入研究。目前牛小梁细胞体外培养技术已趋成熟，能为试验研究提供丰富的细胞，是研究人小梁细胞生物学功能的良好替代方法。我们研究体外培养牛小梁细胞表面整合素表达，探讨其在青光眼发病机制中的意义。

    1  材料与方法

    1.1  牛眼小梁细胞培养及细胞鉴定  采用杨新光等培养方法及本实验室既往方法［1］, 新鲜牛眼常规消毒后, 截取角巩膜缘后5   mm距离，去除虹膜及晶状体等眼前节部分, 在体视显微镜下辨别Schawlbe线以及巩膜突, 以显微镊轻轻撕取乳白色疏松网状小梁组织, 移入培养瓶于37℃培养箱静置0.5～1 h，待组织块贴壁后加入高糖DMEM培养液［含15%胎牛血清,10 mmol/L Hepes（购自Sigma公司）,青霉素、链霉素各100　U/ L，2.5 μg/ml两性霉素B，2　mmol/L谷氨酰胺,于恒温培养箱(37℃, 5%CO2，饱和湿度)培养, 每5 d更换培养液, 倒置荧光显微镜观察细胞生长特性、形态特征, 从形态学角度鉴定细胞。0.25%胰酶和0.02%EDTA混合液消化传代。取第四代细胞接种于预置消毒盖玻片（多聚赖氨酸包被）的24孔培养板(Costar公司产品)中。

    细胞生长近融合期时, 0.01 mol/LPBS(pH　7.2)缓冲液冲洗, 4%多聚甲醛溶液固定, 室温干燥备用。免疫荧光法行神经元特异性烯醇化酶(NSE)及Ⅷ因子相关抗原染色（一抗兔抗NSE，二抗羊抗兔FITCIgG 均购自博士德公司）, 激光共聚焦显微镜下观察以鉴定小梁细胞组织来源。

    1.2  实验方法  免疫荧光法：取已固定细胞玻片, PBS振洗5 min×3次, 滴加羊血清工作液37℃20 min，后甩干，加兔多克隆抗体antiintegrinβ1 (武汉博士德产品, 工作浓度1：200, 0.1 mol/LPBS稀释，4℃过夜, 次日晨, 室温PBS 振洗5 min×3 次,均匀滴加羊抗兔FITCIgG (博士德公司，工作浓度1∶90, BSA配置的PBS稀释至1%),37℃恒温箱30 min,PBS振洗5 min×3次, 500 g·L-1缓冲甘油封片, 行倒置荧光显微镜(400×)观测并摄片。

    免疫酶方法：取已固定细胞玻片, PBS振洗5 min×3次, 3％的H2O2甲醇溶液（1 ml 30% H2O2，9 ml甲醇）灭活内源性过氧化物酶室温20 min，滴加羊血清工作液封闭非特异性抗原37℃20 min，后甩干，加兔多克隆抗体antiintegrinβ1，4℃过夜, 次日晨, 室温PBS 振洗5 min×3 次, 均匀滴加多聚辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG(即用型，北京中衫公司)37℃ 30 min。PBS振洗3次,每次3min，滴加ABC复合剂显色,镜下控制时间。逐级脱水（75%酒精5 min，95%酒精5 min×2，分析纯5 min×2）透明（二甲苯2 min×2），中性树胶封片，镜下（×400）观察。阴性对照以PBS代替一抗。

    2  结果

    2.1  倒置显微镜下观察见细胞生长良好, 呈多角、树枝状、不规则三角形, 多细胞突起（图1）。取传三代细胞进行鉴定（图2），共聚焦显微镜下观察NSE染色阳性, 荧光呈规则散在分布于细胞基质（图3）, 第Ⅷ因子相关抗原阴性。其结果与贺翔鸽相同［2］,证明为神经外胚层神经嵴间充质来源,可以确认所培养细胞为小梁细胞。

    2.2  体外培养牛眼小梁细胞整合素β1免疫荧光和免疫酶染色均呈阳性，荧光信号和棕黄色颗粒阳性信号位于胞膜和胞浆内，阴性对照未见阳性信号（图4～6）。

    3  讨论

    3.1  整合素又称整合蛋白， 主要介导细胞与细胞、细胞与胞外基质之间黏附, 使细胞内骨架与ECM得以整合形成整体。它是由α和β亚基构成的二聚体蛋白,目前发现约有18种α亚基和8种β亚基, 组成25种异二聚体形式，亚基均由胞外区、跨膜区、胞内区组成。胞外区是其与相应配体结合的部位, 识别配体分子中的特定序列, 与层黏连蛋白(laminin)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、胶原(collagen)等胞外基质相结合, 在介导细胞与ECM的信号转导中起重要作用［3］。胞内区可以与踝蛋白(talin)、张力蛋白(tensin)等细胞骨架连接, 引起细胞形态变化。跨膜区可与多种细胞因子共同作用而调节整合素的功能。目前认为在整合素家族中,α亚基与ECM配体的识别有关, β亚基则将信号传至细胞骨架,从而介导细胞内外之间的双向信号传递［4］。研究表明体外培养的人眼小梁网细胞表面表达整合素受体α1、α2、α3、α4、α5、α6、αv、β1、β3 和β5, 其中α3β1、α4β1、α5β1、αvβ1 可以调节细胞和纤维连接蛋白的黏附, α1β1、α3β1、α6β3 可以调节细胞和层黏连蛋白的黏附。尤其是在视神经乳头处这种黏附非常重要，某些亚基通过层粘连蛋白使星型胶质细胞与基底膜牢固结合，而且这些亚基还可感知筛板内部微小的压力变化［5］。整合素β亚单位的胞浆部分与细胞骨架蛋白相连, 细胞骨架蛋白会在胞浆中聚集形成肌动蛋白丝, 后者结构重组形成体积更大的张力纤维,张力纤维又反过来刺激整合素的聚集。通过这种正反馈机制,再加上整合素的胞外部分α亚基与ECM分子结合成复合体，这样整合素便与ECM和细胞骨架蛋白在细胞膜的两边构成复合体,这种复合体即为灶性黏附, 这是细胞与细胞外基质黏附的基础。

    3.2  目前原发性开角型青光眼（primary openangle glaucoma，POAG）的具体发病机制仍未清楚。该病主要特征是小梁组织、尤其是邻管组织内ECM异常沉积，引起房水外流受阻,导致眼压升高, 损害了眼正常结构功能。小梁细胞被覆在小梁柱（由胶原纤维核心及其外围绕的弹力纤维等基质组成）表面，具有分泌调节ECM作用，糖胺多糖、胶原、纤维连接蛋白等胞外基质的含量变化便可直接影响到小梁网眼的大小，近年来关于POAG细胞信号转导［6］，细胞因子与ECM之间关系研究已成热点，整合素作为一种介导细胞和胞外基质的分子，它不仅是细胞内外蛋白的跨膜连接物, 而且还是重要的跨膜传递“信号分子”，有研究FN作为一种重要的细胞外基质成分, 细胞和FN的黏附及肌动蛋白的收缩由FN上CellⅠ和HepⅡ结合域调节，它们与整合素α4β1/α5β1亚基结合通过信号转导途径促进细胞迁移和张力纤维的形成, 再利用肌动蛋白骨架的改变来调节眼内压［7］。另外Peterson等［8］的研究表明，α4β1/α5β1双信号通路汇集可以促进黏附斑和张力丝的大量形成。通过此途径控制人眼小梁细胞的黏附强度和收缩力, 黏附斑的收缩性强可以使其周围小梁网间隙扩大,房水外流阻力减少。另外整合素与基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs)关系密切，可与MMPs 直接结合正向调控MMPs的表达,并且可以黏附ECM和MMPs, 使蛋白酶靠近靶目标，降解ECM。最近有研究［9］半乳凝素8与整合素β1的一种糖基化形式（α23唾液酸葡萄糖）相互作用可以影响小梁细胞的黏附和运动，这或许又为POAG机制提供了新的假说。可以说整合素是一种多生物学效应的黏附分子, 它调节细胞外基质、基质金属蛋白酶作用改变小梁网的状态, 控制房水外流阻力, 其可能在POAG的发病机制中起重要作用, 为便于进一步观察整合素与小梁细胞功能的关系,我们采用免疫荧光与免疫酶技术分别对体外培养牛眼小梁细胞进行integrinβ1亚基检测,发现牛眼小梁细胞表达此蛋白,与人眼小梁细胞一致。因此,我们认为牛眼小梁细胞适合作为研究人眼小梁细胞整合素的良好替代材料,用于今后研究整合素与POAG发病学关系。

【参考文献】
  1］ 王强, 魏厚仁 .体外培养人眼小梁细胞吞噬乳胶微粒的研究［J］.中华眼科杂志,1999,35 (5):389390.

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［3］ Humphries JD，Byron A，Hunphries MJ.Integrin ligands at a glance［J］.J Cell Sci, 2006,119(pt19): 39013903.

［4］ Gindberg MH, Parttidge A, Shattil SJ. Integrin regulation［J］.Curr Opin Cell Biol, 2005, 17(5): 509516.

［5］ Morrison JC. Integrins in the optic nerve head:potential roles in glaucomatous optic neuropathy (an American Ophthalmological Society thesis)［J］.Trans Am Ophthalmol Soc，2006，104:453477.

［6］ Zhang M, Maddala R, Rao PV. Novel molecular insights into RhoA GTPaseinduced resistance to aqueous humor outflow through the trabecular meshwork［J］. Am J Physiol Cell Physiol，2008 ,295(5):C10571070.

［7］ Peterson JA, Peters DM. Heparin II (HepII ) domain of fibronectin modulates rho mediated events in proliferating human trabecular meshwork (HTM) cells via α4Integrin［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci, 2004, 45: 4369.

［8］ Peterson JA, Sheibani N, David G,et al.Heparin II domain of fibronectin uses α4integrin to control focal adhesion and stress fiber formation, independent of syndecan4［J］.J Biol Chem, 2005, 280(8): 69156922.

［9］ Diskin S, Cao Z, Leffler H,et al.The role of integrin glycosylation in galectin8mediated trabecular meshwork cell adhesion and spreading［J］.Glycobiology, 2009 ,19(1):2937.

作者单位：滨州医学院眼科学教研室 滨州市 256603