miR21在白血病发病过程中的作用研究

【摘要】  目的 本实验旨在研究miR21在白血病细胞中表达情况，探讨miR21基因与白血病发病的关系。方法 提取组织中的小于200 bp的RNA,用poly(A)聚合酶在其3′末端加尾，再用5′带40 nt延伸序列的单碱基锚定OligdT引物进行反转录，然后用特异引物进行realtime PCR扩增，从而检测部分miRNAs在白血病细胞株K562中的表达，并与正常人骨髓表达情况相对比。结果 通过realtime PCR 分析，癌基因miR21在K562细胞中的表达量约为(1.73±0.24）×105 个拷贝，明显高于正常人骨髓组织中miR21的表达（P＜0.01）。结论 本研究表明miR21在K562细胞中的表达量增高，可能在白血病的发生过程中起重要作用。

【关键词】  实时定量PCR；miR21；白血病；基因表达

Study of the role of miR21 in leukemia development

    ZHANG Shuai  WANG Pingyu  YIN Juan  et al

    Department of Biochemistry and Molecular Biology, Binzhou Medical University,Yantai  264003

    【Abstract】  Objective  Studing the expression of miR21 in leukemia cells to explore the relationship between miR21 and development of leukemia. Methods  After less than 200bp miRNA was isolated and added with poly A at 3' UTR by polymerase A, the miRNA was reversely conscripted by using 40 nt specific primers for realtime PCR at 5' end. Then, the expression of miR21 was detected in K562 cells and bone marrow cells of health people.Results  The expression level of miR21 in K562 cell was (1.73±0.24）×105 copies, obviously higher than that in health people bone marrow cells by realtime PCR analysis（P＜0.01）.Conclusion  The study demonstrated that the expression of miR21 was upregulated in leukemia cells,which may play an important role in leukemia development.

    【Key words】  reatime PCR, miR21,leukemia，gene expression

    MicroRNA (miRNA)是近几年在真核生物中发现的一类具有调控功能的非编码RNA，大小约为21～25个碱基的单链小分子RNA。miRNA能调节生物体生长、发育和疾病发生过程中有关基因的表达［1，2］，推测这种小分子调控人类近1/3的基因，平均每个miRNA可调节人类200种不同的mRNA表达，并且多个miRNA能够协调调节一些特殊的靶基因［3］。研究发现miRNAs在正常血细胞分化过程中发挥着重要作用，因此miRNAs的异常表达可能与血液系统疾病的发生和发展密切相关。

    目前，随着生物信息学的发展和靶基因实验的确定，有助于揭示miRNAs在调控正常血细胞分化以及相关血液系统肿瘤中的详细分子机制，miRNAs的检测有望成为某些血液系统肿瘤的诊断方法，miRNAs及其靶基因的表达控制也可能成为治疗某些血液系统肿瘤的手段。本研究旨在应用realtime PCR研究miR21在白血病细胞中表达情况，探讨其与白血病发病的关系。

    1  材料与方法

    1.1  细胞培养  K562细胞用10%胎牛血清的DMEM培养基，于5%CO2、37 ℃条件下培养。正常人的骨髓细胞由山东省烟台山医院提供。

    1.2  小RNA的提取  用mirVanaTMmiRNA提取分离试剂盒 (Ambion公司) 从白血病细胞株K562细胞中分离小片断RNA(≤200 nt)。按说明书步骤，从1×106个细胞中提取出小片段RNA溶解在30 μl的无RNA酶水中，紫外分光光度计定量。

    1.3  miRNA的克隆和逆转录  取1.5  μg　RNA和5U多聚（poly）腺苷酸(A)聚合酶置于50 μl反应管中，37℃条件下30 min进行小RNA的多聚腺苷酸化。将带有poly(A)尾的小RNA溶于适量无RNA酶H2O中，在20 μl体积中，应用GeneRacer试剂盒SuperScriptTMⅢRT部分进行反转录：10 μl带有poly(A)尾的小RNA在1 μl反转录引物［5'GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T)243'］、1 μl dNTP混合物(10 mmol/L)和1 μl无菌蒸馏水的孵育作用下，65℃条件下5 min，冰浴1 min，加入5×buffer 4  μl，0.1 mol/L DTT 1 μl，200 U/μl反转录酶1 μl，加水至20 μl，42℃，1 h。最后，反转录酶在70℃条件下孵育15 min灭活。准备cDNA扩增。

    1.4  PCR检测目的miRNA  取上述逆转录得到的cDNA进行PCR扩增：①引物：上游引物P1：5'TAGCTTATCAGACTGATGT3'；下游引物P2：5'CGACAGTTGCTATGCGATGCA3'。② 反应条件：94 ℃ 预变性3 min，1个循环；94 ℃ 变性30 s，60 ℃退火30  s，72 ℃延伸20 s，30个循环； 72 ℃延伸10 min，1个循环，琼脂糖凝胶分离DNA片段。

    1.5  realtime PCR反应 (SYBRGreen Kit［4］)  ①标准品制备：将上述PCR产物连接到T载体上（Invitrogen公司），筛选含有插入片段的载体，将标准品稀释至1×107、1×106、1×105、1×104、1×103copies/μl，使用realtime PCR仪测定定量曲线和标准曲线。② 反应条件：realtime PCR使用RG3000 system (Corbett Research)，变性:95 ℃10 min，延伸95 ℃30 s，68 ℃30 s，72  ℃30 s，40个循环，测定吸光值。

    2  结果

    2.1  RTPCR检测miR21在K562细胞中的表达  结果发现miR21在K562细胞中表达量相对较高，见图1。

    2.2  克隆的质粒DNA鉴定  提取经筛选的用于制作标准曲线模板的质粒DNA,经过PCR及酶切证实,目的片段已连接至T载体上（图2）。

    2.3  realtime PCR 检测miR21在K562细胞中的表达  检测癌基因miR21的表达量约为(1.73±0.24）×105 个拷贝（表1），明显高于对照组。 表1  定量PCR检测miRNA表达量结果

　　3  讨论

    检测miRNA的方法包括Northern blotting［5］，mirVanaTM miRNA Detection (Ambion公司产品)，microarray［6］等，这些基于分子杂交的方法敏感性低，需要的RNA量较大。RTPCR方法是目前检测基因表达最灵敏、可靠的方法，但miRNAs分子太小，用常规的RTPCR检测有局限，需要特殊的设计。

    实时荧光定量 PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1991年Holland等［7］首先报道了运用不可延伸的寡核苷酸杂交探针与模板相结合，然后利用DNA聚合酶5′→3′核酸外切酶的活性将探针切断，使探针的能量传递结构破坏发出荧光来定量PCR产物。1996年PE公司在Holland等运用方法的基础上开发出商用实时荧光定量PCR系列，即Taqman PCR系列。实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。

    研究表明，miR21在胶质母细胞瘤中表达增加，这个基因在肿瘤组织中表达量比正常组织高5～100倍。反义核酸的研究发现这个miRNA 通过抑制凋亡而并非影响细胞增殖控制细胞生长，这预示着这个miRNA具有癌基因的功能。Volinia等［８］对肺癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤细胞进行研究发现，miR20a、miR21、 miR175p等与肿瘤的发生呈正相关。对恶性胆管细胞癌研究发现，癌细胞中miR21、miR141等表达明显增高，而抑制miR21的表达可以增加肿瘤对化疗药物吉西他滨（gemcitabine）的敏感性［9］。上述研究说明miR21作为癌基因在多种肿瘤发生过程中起至关重要的作用。

    本文通过定量PCR实验，检测了miR21在白血病细胞和正常人骨髓细胞中表达的差异，发现miR21在白血病细胞胞株K562细胞中的表达量增高，推测miR21参与白血病的发生，在白血病的发生发展中可能起重要作用。

【参考文献】
  ［1］ Xie X,Lu J,Kulbokas EJ,et al.Systematic discovery of regulatory motifs in human promoters and 3'UTRs by comparison of several mammals［J］.Nature,2005, 434:338345.

［2］ Lim LP,Lau NC, GarrettEngele P,et al.Microarray analysis shows that some microRNAs down regulate large numbers of target mRNAs［J］.Nature, 2005, 433: 769773.

［3］ Krek A,Grun D,Poy MN,et al.Combinatorial microRNA target predictions［J］.Nat Genet, 2005,37:495500.

［4］ Xie SY, Ren ZR, Zhang JZ,et al.Restoration of the balanced α/βglobin gene expression in β 654thalassemia mice using combined RNAi and antisense RNA approach［J］.Hum Mol Genet, 2007,16:26162625.

［5］ Carrington JC,Ambros V.Role microRNAs inplantand animal development［J］.Science,2003,301:336338.

［6］ Hutvagner G, Zamore PD.A microRNA in a multiple turnover RNAi enzyme complex［J］.Science,2002,297:20562060.

［7］ Altuvia Y,Landgraf P,Lithwick G,et al.Clustering and conservation patterns of human microRNAs［J］.Nucleic Acids Res,2005,33:26972706.

［8］ Volinia S, Calin GA, Liu CG,et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006,103:22572261.

［9］ Meng F, Henson R, Lang M,et al.Involvement of human microRNA in growth and response to chemotherapy in human cholangiocarcinoma cell lines［J］.Gastroenterology，2006,130:21132129.

作者单位：1 滨州医学院生物化学与分子生物学教研室 烟台市 264003；2 滨州医学院卫生学教研室