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【摘要】 目的 研究5氟尿嘧啶抑制人肺腺癌细胞生长的作用方式。方法 用不同浓度的5氟尿嘧啶处理体外培养的人肺癌A549细胞，应用MTT法、倒置相差显微镜和吖啶橙染色法分析检测A549细胞存活率的变化及细胞形态结构的变化。结果不同浓度的5氟尿嘧啶处理A549细胞，随着药物浓度的增加和处理时间的延长，细胞存活率明显下降;且低浓度使细胞呈铺展状态，细胞质内空泡增多，吖啶橙染色显示酸性膜泡增多，高浓度使细胞变圆，出现凋亡状态。结论 5氟尿嘧啶能明显抑制A549细胞的生长，低浓度诱导细胞发生自噬，高浓度引起细胞凋亡。
【关键词】 5氟尿嘧啶;肺癌;自噬;凋亡
Effects of 5fluorouracil on lung adenocarcinoma A549 cell growth inhibition mechanism
ZHANG Dehai ZHANG Qing ZHANG Cuiyun et al
Binzhou Medical University,Binzhou 256603
【Abstract】 Objective To study the inhibitive effect of 5fluorouracil on the growth of human lung carcinoma cells A549.Methods With different concentrations of 5fluorouracil in vitro processing of human lung cancer A549 cells,MTT assay,inverted microscope and acridine orange staining were used to determine cell viability and morphological changes.Results Using different concentrations of 5fluorouracil to deal with A549 cells, with the increase in drug concentration and treatment time,cell survival rate decreased significantly;and low concentration of 5fluorouracil induced the cell spread and increased vacuolization within the cytoplasm, acridine orange staining showed an increase in acidic vesicles,high concentration made the cell round and cell apoptosis.Conclusion 5fluorouracil inhibited the growth of A549 cells significantly,with autophagy by low concentrations and apoptosis by high concentrations.
【Key words】 5fluorouracil，lung cancer，autophagy，apoptosis
5氟尿嘧啶( 5fluorouracil, 5Fu)是临床上常见的抗肿瘤化疗药物，它可以抑制肿瘤细胞生长[1],常用于治疗结直肠癌、消化道癌、乳腺癌、绒毛膜上皮癌等多种恶性肿瘤。5Fu是一种嘧啶类似物,可在细胞内转化成不同的细胞毒性代谢产物，与DNA和RNA结合，从而干扰DNA和RNA的合成，从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用，但其抑制肿瘤细胞生长的作用机制尚不清楚。近年来，国内外许多研究表明，5氟尿嘧啶抑制肿瘤细胞生长是通过诱导细实现的[2，3];而也有研究证明，5氟尿嘧啶能诱导细胞发生自噬[4]。本研究以人肺腺癌A549细胞为例，来探讨5氟尿嘧啶抑制人肺腺癌A549细胞生长的作用机制，以期为临床治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 人肺腺癌A549细胞，HAM′S/F12细胞培养液(美国GIBCOBRL公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰酶(上海生工)，二甲基亚砜(Sigma公司)。5氟尿嘧啶(深圳万乐药业有限公司)用二甲基亚砜(DMSO)溶解。
1.2 细胞培养 A549肺癌细胞系在含10%胎牛血清的HAM′S/F12培养基中，置于37℃，5% CO2 饱和湿度的培养箱中培养。每3 d半量换液传代，实验中选用对数生长期细胞。5Fu用DMSO溶解成1 mol/L储存液-20℃保存，使用前用细胞培养液稀释成所需浓度。
1.3 实验分组 根据加入的5氟尿嘧啶浓度不同将细胞分组：①对照组;②加药组(分别为5、10、20、40、80、100、200、300、400 μM)。将各组细胞接种到24孔和96孔板中，每孔细胞浓度为2×104/ml，置于37℃、5% CO2 饱和湿度的培养箱中培养24 h后加药，分别于加药后24、48 h进行观察和分析。
1.4 细胞形态学观察 各组细胞加药24、48 h后，倒置相差显微镜下观察24、48 h细胞形态变化。
1.5 MTT法检测细胞琥珀酸脱氢酶的活性 将上述培养于96孔板中的细胞根据实验分组加入不同浓度的5氟尿嘧啶，于各组药物处理终止前4 h每孔加入5 mg/ml MTT液20 μl，继续培养4 h，然后小心吸出各孔内培养液，加入100 μl DMSO，振荡至结晶全部溶解，酶标仪上570 nm测定光密度(OD值)。取各平行孔OD值的平均值,根据下式计算细胞相对存活率: 存活细胞% = (实验组OD 值/对照组OD 值)×100%(以不含细胞的培养液为空白组调零) 。
1.6 吖啶橙染色观察细胞质内酸性膜泡变化 上述培养于24孔板中的细胞用不同浓度的5氟尿嘧啶处理48 h后，将旧培养液吸出，PBS洗两遍，加入两滴0.1 mg/ml吖啶橙染液染色1 min，PBS洗两遍，于倒置荧光显微镜下观察结果。
1.7 统计学处理 实验数据以x±s表示,经重复测量资料的方差分析,P<0.05 表示有统计学意义。
2 结果
2.1 5氟尿嘧啶对A549细胞存活率的影响 用MTT法检测了5氟尿嘧啶对A549 细胞增殖的影响(表1)。用5、10、20、40、80、100、200、300、400 μM 的5氟尿嘧啶，分别处理A549 细胞24、48 h。数据显示，5氟尿嘧啶对A549细胞的影响表现出一定的浓度和时间依赖性关系。随药物处理时间的延长，细胞存活率降低;随药物浓度的增加，细胞存活率也表现出降低趋势。 表1 5Fu对A549细胞存活率的影注：单因素方差分析P<0.01，进一步两两比较(同一时间段
不同加药浓度组与对照组相比)P均小于0.01
2.2 5氟尿嘧啶对A549细胞形态学影响：A549 细胞经不同浓度的5氟尿嘧啶处理48 h后，在倒置显微镜下观察细胞形态变化(图1)，发现10～100 μM处理组细胞质出现明显的空泡化，且10、20 μM 组空泡化现象尤其明显;300 μM处理组细胞出现明显的细胞凋亡特征;400 μM处理组除有凋亡外还出现了明显的细胞坏死现象。
2.3 吖啶橙染色观察细胞质变化 为了进一步明确5氟尿嘧啶处理A549细胞后引起的细胞质的变化，我们用吖啶橙染色来观察细胞质内酸性膜泡的变化。不同浓度的5氟尿嘧啶处理A549 细胞48h后，吖啶橙染色结果发现(图2)，与对照组相比5氟尿嘧啶处理组细胞质内酸性膜泡均明显增多，且10、20 μM处理组尤为明显，这与形态观察结果一致。
3 讨论
目前，多数学者将细胞的死亡形式分为凋亡 (apoptosis)、自噬性细胞死亡(autophagy)和坏死(necrosis)三种类型 [5，6]，其中凋亡和自噬性细胞死亡属于程序性细胞死亡(programmed cell death)，分别被称为Ⅰ型程序性细胞死亡和Ⅱ型程序性细胞死亡。多年来，人们对Ⅰ型程序性细胞死亡——细胞凋亡的形态学、参与分子及其调控机制的研究颇多，对其在抑制肿瘤细胞生长中的作用较为了解，而对Ⅱ型程序性细胞死亡——细胞自噬，了解较少。自噬是细胞内的物质成分被溶酶体降解的统称，它是真核细胞所特有的，负责长寿命蛋白和一些细胞器的降解再利用[7]，在生物体的发育、正常生理活动和许多疾病中发挥重要作用。近年来许多研究表明，自噬与肿瘤的关系非常密切，像凋亡一样，自噬在调节癌症的发生，发展和决定肿瘤细胞对抗癌治疗的反应等方面起着很重要的作用，然而，对这一作用，研究者们颇有争议，至今尚无定论。
本实验细胞存活率检测结果表明(表1)，用不同浓度的5氟尿嘧啶处理A549细胞24、48 h，细胞存活率均呈现浓度和时间的依赖性关系，说明5氟尿嘧啶具有抑制肺腺癌细胞生长的作用。形态学观察结果显示(图1)，随5氟尿嘧啶浓度的增高，细胞表现出不同的反应：低浓度(<200 μM)时，细胞呈铺展状态，细胞质内空泡增多;高浓度(≥300 μM)时，细胞变圆，出现凋亡现象。这一结果提示，5氟尿嘧啶抑制肺腺癌A549细胞生长的作用方式可能是低浓度时诱导细胞发生自噬、高浓度时引起细胞凋亡。细胞自噬可能是在应激条件下被激活，起到延缓细胞凋亡的作用。为了进一步证实5氟尿嘧啶低浓度时是否诱导了细胞自噬的发生，我们采用吖啶橙染色方法来观察自噬泡(autophagic vacuoles)是否存在。吖啶橙染色结果显示(图2)，不同浓度的5氟尿嘧啶处理细胞后，细胞质内的酸性膜泡增多，而且5氟尿嘧啶10、20 μM处理组细胞内酸性膜泡最多，随药物浓度的增高，细胞内酸性膜泡逐渐减少。近年来，用吖啶橙染色法来观察应激条件下细胞质内酸性膜泡的变化，已经成为一种常用的鉴别细胞自噬的方法[8]。因此，我们的实验结果表明，5氟尿嘧啶低浓度处理A549细胞时，诱导了细胞自噬的发生。
以往许多研究表明，5氟尿嘧啶抗肿瘤的机制是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的，而如今临床治疗发现，5氟尿嘧啶的耐药性在治疗过程中已变得非常普遍，成为治疗失败的重要原因。最新有研究证明，5氟尿嘧啶能够诱导结肠癌细胞发生自噬[9]，提示自噬在5Fu治疗肿瘤的过程中有不可忽视的作用。我们上述研究也发现，低浓度的5氟尿嘧啶能诱导人肺腺癌A549细胞发生自噬，高浓度的5氟尿嘧啶能引起A549细胞凋亡甚至坏死。因此，探索肿瘤细胞自噬的机制，阻断自噬的发生，降低肿瘤耐药性，可能是降低药物毒性提高肿瘤治疗效率的新策略。
(致谢：感谢滨州医学院李尊岭老师馈赠人肺腺癌A549细胞。)
【参考文献】
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作者单位：滨州医学院 滨州市 256603