CD34、CD59在阵发性睡眠性血红蛋白尿中的表达及意义

【摘要】  目的 研究阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)患者骨髓CD34+细胞比率及外周血粒、红细胞CD59表达阳性率并探讨其临床意义。方法 采用流式细胞术检测20例PNH患者骨髓单个核细胞(BMMNC)中CD34+细胞比率及外周血中粒、红细胞CD59表达阳性率。 结果 PNH患者CD34+细胞比率显著低于正常人(P<0.01);其中增生减低组CD34+细胞比率低于增生活跃、增生明显活跃组(P均<0.05)，而后两组之间差异无显著性(P>0.05)。正常人外周血粒、红细胞CD59表达阳性率均>95%，其中粒细胞CD59表达稳定性较好;PNH患者外周血粒、红细胞CD59表达阳性率与正常对照组相比均显著减低(P<0.01);粒细胞CD59在不发、偶发、频发组中表达逐渐减低且差异均有显著性(P<0.05)，红细胞CD59表达则在三组之间差异无显著性(P>0.05)。 结论 CD34+造血干细胞减少可能参与PNH发病;外周血粒、红细胞CD59检测是诊断PNH的特异性及敏感性方法，其中粒细胞CD59缺失程度对判断病情严重与否具参考价值。

【关键词】  阵发性睡眠性血红蛋白尿;CD34;CD59;流式细胞术

Expression of CD34 and CD59 in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and their clinical significance

　　WANG Xuexia SUN Jianrong GAO Na YU Wenzheng ZHANG Huadao

　　Department of Hematology，Affiliated Hospital of Binzhou Medical University，Binzhou 256603

　　【Abstract】 Objective To study the bone marrow CD34+ cell ratio and positive expression of CD59 on granulocytes and erythrocytes from peripheral blood in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria(PNH) and to explore their clinical significance.Methods

　　The ratio of CD34+ cell in bone marrow mononuclear cells(BMMNC) and expression of CD59 on peripheral granulocytes and erythrocytes in 20 patients with PNH were detected by flow cytometry along with labelled CD34 and CD59 monoclonal antibodies.Results The ratio of CD34+ cell in PNH patients was significantly lower than that in control group (P<0.01). There was a significant difference between hypocellular PNH and normo/hypercellular PNH(P<0.05)，but no difference was found between the two latter groups(P>0.05). The positive expression ratio of CD59 on peripheral granulocytes and erythrocytes in control group were all more than 95% and the former had a better stability.The expression of CD59 on both granulocytes and erythrocytes in PNH patients remarkably decreased as compared with that in control group (P<0.01 ).There was a significant difference of the expression of CD59 on peripheral granulocytes among the frequent，occasional and no hemoglobinuria group(P<0.05) while there was no significant difference of the expression of CD59 on erythrocytes among the three groups (P>0.05).Conclusion The reduction of CD34+ hematopoietic stem cells may be involved in the pathogenesis of PNH. Detection of CD59 on granulocytes and erythrocytes from peripheral blood could be considered as a specific and sensitive method for the diagnosis of PNH. The deficiency of CD59 on granulocytes is related to the severity of disease.

　　【Key words】 paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，CD34，CD59，flow cytometry

　　阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)是一种后天获得性造血干细胞PIGA基因缺陷导致糖化磷脂酰肌醇(GPI)合成障碍而引起GPI锚蛋白缺失的慢性溶血性疾患，临床主要表现为补体介导血管内溶血、全血细胞减少、静脉血栓形成倾向三大特征。为了进一步揭示PNH疾病本质，探讨其特异性诊断指标和理想治疗靶点，我们利用流式细胞术对PNH患者骨髓单个核细胞(BMMNC)CD34及外周血粒、红细胞CD59 的表达进行了检测，现将研究结果报告如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象 PNH患者20例均系2007年1月—2008年12月我院血液内科门诊及住院患者;其中男11例，女9例;年龄23～67岁，中位年龄41岁;按血红蛋白尿发作分为频发组8例、偶发组7例、不发组5例;按骨髓增生程度分为增生减低组6例、增生活跃组9例、增生明显活跃组5例;所有病例均符合文献诊断标准[1]。骨髓正常对照组8例系胸外科非血液疾患行手术切除肋骨者;外周血正常对照组10例系健康体检者。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 主要试剂与设备：贝克曼库尔特流式细胞仪FC500、IgG单克隆抗体FITC、CD34单克隆抗体FITC、Optilys溶血素为美国贝克曼库尔特公司产品，CD59单克隆抗体PE、IgG单克隆抗体PE、红细胞裂解液FACS为BD公司产品。

　　1.2.2 标本采集及处理：常规穿刺抽取髓液2 ml于EDTA抗凝管中混匀，采用淋巴细胞分离液分离BMMNC，调整细胞数为1×107/ml备用;采集晨起空腹静脉血2 ml，EDTA抗凝。

　　1.2.3 BMMNC表面CD34表达：PBS洗涤BMMNC 1次，细胞沉淀加溶血剂及透膜剂各500 μl并轻轻混匀，室温避光作用10 min，PBS洗涤1次，去上清，细胞沉淀用PBS调制成细胞浓度为106/ml的单细胞悬液。分别取100 μl　BMMNC悬液加入两个试管中，对照管中加20 μl IgG单抗FITC，试验管中加20 μl CD34 单抗，轻轻振荡混匀，室温避光放置15 min，2 h内采用FCM分析。

　　1.2.4 外周血粒细胞表面CD59表达：分设实验管和对照管，每管加入约含106/ml个粒细胞的抗凝全血100 μl。对照管加入20 μl IgG单克隆抗体PE、10 μl IgG单克隆抗体PC5，实验管加入20 μl CD59单克隆抗体PE、10 μl CD45单克隆抗体PC5;混匀，室温避光孵育30 min。加入2 ml红细胞裂解液，静置10 min，1000 r·min-1离心10 min，PBS洗涤2次，弃上清，加入PBS　1 ml悬浮细胞，30 min内上机检测。

　　1.2.5 外周血红细胞表面CD59表达：将EDTA抗凝全血采用密度梯度离心法取得红细胞并加入PBS制成106/ml红细胞悬液;分设实验管和对照管，每管加入红细胞悬液100 μl。对照管加入20 μl IgG单克隆抗体PE，实验管加入20 μl CD59单克隆抗体PE;混匀，室温避光孵育30 min，PBS洗涤2次，弃上清，加入PBS 1 ml悬浮细胞，30 min内上机检测。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS统计软件包进行数据处理与分析，数据以x±s表示，采用方差分析和多组间两两比较q检验。

　　2 结果

　　2.1 PNH各组、正常对照组BMMNC中CD34+细胞比率，见表1。表1 PNH患者和正常人BMMNC中CD34+细胞比率组别

　　经方差分析，PNH各组BMMNC中CD34+细胞比率与正常对照组相比显著降低(P均<0.01);其中增生减低组CD34+细胞比率显著低于增生活跃、增生明显活跃组(P均<0.05)，而后两组之间比较差异无显著性(P>0.05)。

　　2.2 PNH各组、正常对照组外周血粒、红细胞CD59表达率见表2。表2 PNH患者和正常人外周血粒、红细胞CD59表达率组别

　　10例正常人外周血粒细胞和红细胞CD59表达阳性率均>95%，其中粒细胞CD59表达稳定性较好，红细胞CD59表达个体差异稍大。经方差分析，PNH患者粒、红细胞CD59表达阳性率(均<90%)与正常对照组相比显著减低(P均<0.001)。将PNH患者按病情分为不发组、偶发组、频发组，粒细胞CD59在不发、偶发、频发组中表达阳性率逐渐降低，三组之间两两比较差异均有显著性(P均<0.05);红细胞CD59在不发、偶发、频发组中表达阳性率虽依次有所降低，但三组之间两两比较差异无显著性(P均>0.05)。

　　3 讨论

　　目前研究[2]认为，PNH系由于起源于造血干细胞水平的X染色体PIGA基因突变(Xp22.1)导致GPI合成障碍而引起血细胞表面GPI锚蛋白缺失的获得性溶血性疾患;其亦属于造血干细胞疾患范畴，但一显著特征是体内正常造血克隆与异常PNH克隆同时并存。PNH造血干细胞生物学特性与常人有何不同、异常克隆何以长期生存并逐渐扩增、如何准确检测异常克隆并早期诊断PNH一直是临床关注与研究的热点。

　　造血干细胞(HSC)的免疫表型特征为CD34+、Ckit+、CD38-、HLADR-、Lin-、CD45RA-、CD7-，其中最重要的是CD34分子。CD34分子是一种分子量为1.15×105的I型跨膜蛋白分子，其并非造血干细胞所特有，可从干细胞开始连续表达直至造血前体细胞，但表达量随细胞分化程度的提高而逐渐减低。近年来，随着单抗技术的逐步推广和FCM的广泛应用，直接检测骨髓CD34+细胞已成为一种简单、快速、准确鉴定HSC的方法并逐渐用于临床常规检查。

　　本研究表明，PNH患者CD34+细胞比率明显低于正常对照组，且其减低程度与骨髓增生程度具相关性，骨髓增生减低的PNH患者CD34+细胞比率减低尤为显著;说明PNH虽因干细胞PIGA基因突变导致异常克隆产生，但相对于正常人其CD34+造血干细胞在数量上仍远远不足，亦即提示PNH异常克隆本身可能并不具备内在增殖优势，而是在骨髓正常造血功能衰竭的基础上才取得相对生长优势而得以维持与扩增。肖娟等[3]亦发现PNH患者骨髓CD34+造血干/祖细胞比正常人少，而且其中CD59细胞明显多于CD59+细胞，提示PNH患者正常造血干/祖细胞数量减少、异常造血干/祖细胞在数量上占有相对优势;Keller等[4]则通过PIGA基因突变的小鼠模型研究证实，单独PIGA基因突变并非PNH克隆获得增殖优势而导致PNH发病的唯一原因。目前趋向认同，PNH的出现是机体在骨髓衰竭背景下发生基因突变，导致血细胞表面GPI锚蛋白缺失，从而使缺陷细胞逃避免疫系统T细胞的杀伤而得以生存下来并进一步扩增，即机体以溶血为代价而避免了更为严重的骨髓衰竭[5];此为PNH发病的双重打击学说，亦从侧面阐释了为何PNH与骨髓造血衰竭性疾患再生障碍性贫血(AA)关系密切且可相互转化与共存。

　　PNH发病过程中GPI锚蛋白尤以补体调节蛋白CD55(衰变加速因子，DAF)和CD59(反应性溶血膜抑制物，MRIL)最为重要;前者可加速补体C3转化酶的衰变从而抑制补体的激活，后者则可通过与补体C9结合而抑制膜攻击复合物的形成;因CD55、CD59存在于所有血细胞表面且与补体溶血关系密切，故而将两者缺失作为PNH克隆的标记[2]。近年来，应用流式细胞术和单克隆抗体技术直接检测血细胞表面GPI锚蛋白CD55、CD59的缺失已成为临床诊断PNH的新型方法，当CD55-或CD59-细胞占3%～5%时即可检出，此与传统的酸化血清溶血试验(Ham试验)相比敏感性更高、特异性更强;其中CD59的检测尤为可靠[6]。

　　本组研究发现，10例正常人外周血粒、红细胞CD59表达阳性率均>95%，其中尤以粒细胞CD59表达稳定性为好。20例PNH患者粒、红细胞CD59表达阳性率与正常对照相比均显著降低;其中粒细胞CD59在不发、偶发、频发组中表达渐次减低，三组之间比较差异有显著性;红细胞CD59表达则三组之间无显著差异;提示外周血粒、红细胞CD59缺失对PNH诊断具较高特异性及敏感性，其中粒细胞CD59缺失程度对判断病情严重与否具参考价值。此与黎纬明等[7]报道基本一致。研究表明[8]，在PNH克隆发展过程中，首先累及的是粒细胞，其数量受输血、溶血因素影响较小且CD59粒细胞多可被最早检出且百分率最高，因而粒细胞CD59检测对PNH早期诊断具重要价值。尽管如此，临床实际工作中仍有不少PNH病例单用流式细胞仪CD59检测不易确诊。Brodsky等[9]发现嗜水气单胞菌属细菌产生的毒素aerolysin可通过与GPI蛋白连接在细胞膜上形成通道而导致正常细胞溶破，PNH细胞则由于缺乏GPI蛋白使其具抵抗毒素作用而最终保持细胞完好;将在此基础上加以技术改进制成的Alexa488标记前aerolysin变异体(Flaer)联合CD59来检测PNH克隆，可大大提高诊断的敏感性与特异性，在日后临床应用上具广阔前景。

【参考文献】
  　[1] 张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].第2版.北京：北京科学出版社，1998:3338.

　　[2] Rosti V. The molecular basis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria[J].Haemotology，2000，85(1)：8287.

　　[3] 肖娟，武永吉，张之南，等. 阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓CD34+CD59+细胞与CD34+CD59-细胞生物学性能的研究[J].中华血液学杂志，2003，24(4)：169173.

　　[4] Keller P，Payne JL，Tremml G，et al.FESCre targets phosphatidylinositol glycan class A (PIGA) inactivation to hematopoietic stem cells in the bone marrow[J].J Exp Med，2001,194(5)：581589.

　　[5] Karadimitris A, Manavalan JS, Thaler HT,et al.Abnormal Tcell repertoire is consistent with immune process underlying the pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria[J].Blood， 2000,96：26132620.

　　[6] Pilar MH，Marta MA，Julia A，et al.Comparative analysis of different flow cytometry based immunophenotypic methods for the analysis of CD55 and CD59 expression on major peripheral blood cell subsets[J].Cytometry，2002，50(3)：191201.

　　[7] 黎纬明，李菁媛，邹萍，等.干细胞缺陷性疾病患者两种GPI锚蛋白表达及临床意义[J].中国临床医学，2007，14(4)：606608.

　　[8] Hillmen P. Implications of recent insights into the pathophysiology of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria[J].Br J Haemaol，2000，74(1)：4252.

　　[9] Brodsky RA，Mukhina GL，Nelson KL，et al.Resistance of cells to the glycosylphosphatidlinositolbinding toxin aerolysin[J].Blood，1999，93(5)：17491756.