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摘要:目的 了解金黄色葡萄球菌的生物化学和代谢特征，以及其半乳糖醇酶与产生肠毒素的关系。 方法 利用PCR方法从金黄色葡萄球菌标准株中扩增出金黄色葡萄球菌半乳糖醇酶，克隆到pmD-18T载体上并转化到E.coli JM109菌株。 结果 用特异引物扩增800bp的基因片段，目的基因被克隆，经双酶切和DNA序列测定为金黄色葡萄球菌半乳糖醇酶基因。 结论 金黄色葡萄球菌半乳糖醇酶基因片段可以被特异性扩增和克隆。
关键词:金黄色葡萄球菌;基因克隆;半乳糖醇酶
Cloning of dulcitol enzyme gene of staphylacoccus aureus.
HE Lian-hua，GAO Shi-tong，GENG Yi-jie，et al.
（Shen-zhen Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen518020，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To understand the character of biochemistry and motabolism of Staphylococcus aureus，and relationship between entertoxin product and expression of dulcitol enzyme gene. Methods Dulcitol enzyme gene of Staphylococcus aureuswas amplified from Staphylococcus aureus genome with PCR，gene was cloned into pmD-18T，then was transferred to E.coli JM109. Results 800bp gene fragment was amplified by PCR from Staphylococcus aureusgenome，and also was cloned plasmid pmD-18T，farget gene was identified from transferred on to plasmid pmD-18T by the way of DNA sequence and double enzyme cut. Conclu-sion Dulcitol enzyme gene of Staphylococcus aureus could be amplified and cloned specially.
Key words:Staphylococcus aureus;Gene cloning;Dulcitol enzyme
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是导致人畜共患细菌病的重要病原体之一，其代谢产物肠毒素是引起食物中毒的主要成分，可引起人和动物败血症、肺炎、肠炎、皮肤软组织感染等，其突变菌种是引起院内感染的主要病原体 ［1～3］ 。目前细菌分离培养是金黄色葡萄球菌检测的常规方法，该法费时、费力，不能满足快速检测的需要，国外采用放射免疫和酶联免疫法进行检测，但国内还未推广引用 ［4～6］ 。
金黄色葡萄球菌能产生多种毒力强度不同的毒素和酶，其中nuc基因编码的耐热核酸酶（Themostable nuclease，Themonuclease［Tnase］），不仅为金黄色葡萄球菌所特有，而且在不同株之间具有较高的保守性;半乳糖醇酶又称卫矛醇酶（Dulcitol enzyme）的基因表达可能与肠毒素的产生有密切的关系，了解这个基因及其产物的生物学功能，对于研究肠毒素的产生及其抑制具有重要意义，同时为半乳糖醇酶类药物的研究和开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 金黄色葡萄球菌和E.coli JM109为本室保存;7.5%NaCl肉汤培养基和LB培养基为本室配制;Taq DNA polymerase，buffer，dNTP，T4DNA Ligase，pmD-18T载体，胶回收及质粒提取试剂盒均购自大连宝生物公司;琼脂糖购自BBI生物制品公司，其余产品均为国产分析纯;Sprint PCR仪是英国Hybaid公司产品，离心micromax;230由IEC（International E-quip2ment Company）公司制造，基因脉冲转化仪为Bio2Rad产品;DF2D电泳仪为北京东方特力科贸中心产品。
1.2 方法
1.2.1 PCR引物设计及反应条件根据文献设计一对特异性引物:F5'-GGATCC AGCG AGA AAA GCG;R-3'R5'-GCGC GTCGAC ACTT GTA TAT AAA T-3'，PCR条件:97℃1min。95℃45s;40℃45s;72℃1min，共30个循环。72℃5min，以金葡菌半乳糖醇酶基因组DNA为模板，按照上面的条件进行PCR扩增。1.2.2 PCR产物回收 按大连宝生物公司试剂盒说明使用。
1.2.3 PCR产物与T载体的连接 按下列体系混合:PCR产物4μl，PmD-18T载体1μl，solution5μl共10μl，于15℃过夜。取5μl转化感受态细胞。
1.2.4 感受态细胞的制备和转化方法将JM109LB培养基于37℃摇床培养过夜，然后按第三版《分子克隆实验指南》中的方法操作。
1.2.5 DNA序列测定 将6个阳性克隆同时以DNA序列分析仪（Perkin Elmer）进行序列测定，按照Renli Zhang所描述的方法（Parasit.Int.，2000，48:233～242.）。
2 结果
2.1 金葡菌半乳糖醇酶基因组DNA的提取 接种金葡菌于7.5%NaCl肉汤培养基中（含50mg/L Amp），37℃摇床培养过夜，离心得细菌。按照文献 ［7］ 提取基因组DNA，结果见图1（略）。
2.2 基因克隆及筛选 被扩增目的DNA装入T载体转入E.coli JM109感受态细胞后，将其涂于带有Amp抗生素的LB平板上放于37℃温箱培养过夜。第2d挑菌保种并进行PCR对半乳糖醇酶基因进行扩增。电泳可以看出有效地扩增出所预期的约700bp的特异带。
2.3 酶切鉴定 用北京赛百盛基因技术公司的质粒提取试剂盒对筛选的阳性克隆菌株液体培养提取质粒，用BamⅠ和SalⅠ进行双酶切，切出约800bpDNA片段，如图3（略）所示。
2.4 重组质粒的序列测定 经PCR扩增和双酶切证实的阳性克隆进一步进行DNA序列测定，DNA序列测定的结果表明克隆的目的基因片段与基因文库所登录的金黄色葡萄球菌半乳糖醇酶基因序列有99%的同源性（dbjAP004822Staphylococcus aureus subsp.au-reus MW2DNA，complete genome，strain:MW2）。
3 讨论
从食物中毒样品中分离出的强毒力株金黄色葡萄球菌作为模板，利用PCR技术成功地扩增出半乳糖醇酶基因，并克隆了半乳糖醇酶基因，且在原核或真核细胞成功表达，对金黄色葡萄球菌生理及其生物化学特性提供了一定的条件。
本研究通过对金黄色葡萄球菌分离株半乳糖醇酶基因部分序列测定，进一步证实了克隆的可靠性。从食物中毒样品中分离出的强毒力株半乳糖醇酶基因，与基因GenBank收录的金黄色葡萄球菌日本株乳糖醇酶基因的相应序列有较高的同源性（99%），说明金黄色葡萄球菌乳糖醇酶基因有较高的保守性。
金黄色葡萄球菌是引起医院感染和细菌性食物中毒的主要病原体，该菌可以分泌20多种毒蛋白，克隆和表达这些基因、分析其功能及其生物化学特征及其了解其毒性的机理是很有必要的。
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作者单位:深圳市疾病预防控制中心，广东深圳 518020.
作者简介:贺连华（），女，主管技师，主要从事病原生物学研究.
通讯作者:张仁利，MD，Ph.D.深圳市疾病预防控制中心分子生物学研究室.
收稿日期:2005-04-10