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摘要:目的 了解假结核菌F 2 株对小白鼠的侵袭性和机体内的带菌情况。 方法 用F 2 株在肉汤管内培养48h后，加入适量碳酸氢钠盛于喂饮瓶对1～8组共32只只小白鼠自然饮食3～8d，第9组只以饲料伴食，作为空白对照。在不同时间采血检测抗假结核菌抗体，同时剖取脏器分别压印培养和4℃增菌后划皿分离培养。 结果 小白鼠脾肿大明显，肝、脾压印直接和增菌10d、20d、30d转YSA培养基划线均阴性，而胃、回盲脏器经增菌10d、20d、30d转YSA培养基划线分离出8株目标菌。 结论 假结核耶氏菌F 2 株对小白鼠具有侵袭性和不致死性。
关键词:假结核菌;侵袭性;带菌部位;小白鼠
Study on Yersinia pseudotuberculosis F 2 strain upon mice infestivity.
ZENGMin，YANG Hua-yuan，HUANG Ji-ying，et al.
（Zhanjiang Municipal Institute for control of plague，Zhanjiang524037，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To understand the infectivity of Yersinia pseudotuberculosisF 2 strain on mice and their bacterium-carry-ing condition. Methods Thirty-six mice were divided into9groups each consisted of4mice.Group1～8was taken as experi-mental groups and group9was as control.Yersinia pseudotuberculosis F 2 strain was cultured in broth test tube for48hours and then put in feeding bottles containing sodium bicarbonate solution.The mice in experimental groups were fed for3-8days and blood sam-ples were taken from the mice at different time for detection the antibodies against Yersinia pseudotuberculosis，the dissected mice or-gans were under separate impression culture and then cultured at4℃after propagating bacteria for a period of10～30days. Re-sults The spleen of the mice in the experimental groups was obviously enlarged and eight target bacteria strains were isolated. Conclusion Yersinia pseudotuberculosis F 2 strain was infective to mice but the infection was not lethal.
Key words:Yersinia pseudotuberculosis;Infectivity;Bacterium-carrying site;Mice
假结核耶氏菌是一种人畜共患消化道传染病病菌，在80年代国外一些国家将其列为肠道主要传染病菌，又因与鼠疫菌和小肠结肠炎菌有共同抗原，在自然界有拮抗或替代，为查清鼠疫静息期与鼠疫疫源地存在关系。因此用假结核菌F 2 株（以下简称F 2 株）感染小白鼠，了解其侵袭性和小鼠体内器官的带菌情况。为在实际工作中检测菌株提供实验参考依据。
1 材料和方法
1.1 材料 F 2 株菌株（由中国CDC传染病所腹泻病原室提供）;小白鼠18～22g（由广东省医学院动物室提供），正常饲养3d后选取健康36只（雌雄各半），随机抽样分成9组，每组4只;1～8组为试验组，并按顺序从1～32编号;F2株阳性诊断血清由本室制备;沙门氏菌属A-FO群多价血清、志贺氏菌属四种多价诊断血清均购于兰州生物制品研究所（20040201）;生化管和增菌液皆由本室制备;Yersinia Selective Agar（简称YSA）分离培养基由中国CDC提供。
1.2 方法
1.2.1 菌液制备和染菌 F 2 株在斜面置28℃36h取一白金耳于300ml普通肉汤瓶内28℃48h后，加入适量碳酸氢钠盛于喂饮瓶中。1～4组（1～16号）饮菌前每鼠经腹腔注射FeSO 4 500g/只，饮菌第3d再注射Fe-SO 4 600g/只;5～8组（17～32号）未注射FeSO 4 ，1～8组同时给予菌液让其自然连续饮食，另加饲料伴食。第9组为对照组。
1.2.2 感染观察 观察小白鼠精神、食欲、步态、粪便性状，称量并计算每天平均每只鼠所饮菌量和饲料消耗量。
1.2.3 解剖培养 1、5组饮菌3d停48h，2、6组饮菌8d停6h，3、7组饮菌8d停20h，分别无菌放血解剖;4、8组饮菌8d停36h各取3只无菌放血解剖，余下2只继续饲养到30d无菌放血解剖。观察脏器，分别取肝、脾切面压印培养，同时另取黄豆大小于1%卵黄肉汤管内4℃增菌;再取舌、胃、肺、肠系膜淋巴、肾和回盲部内容物适量置于改良PBS管内置4℃增菌。从每份标本增菌液中分别10d、20d、30d各取一白金耳于YSA培养基上划皿置28℃48h挑取可疑菌落涂片镜检，选取G - 杆菌，在双铁糖斜面产酸不产气，与A-FO、志贺氏血清不凝集菌，再作生化和F2株诊断血清凝集试验。
1.2.4 对照组 用肉汤让其自然连续饮食，同时另加饲料伴食5d，无菌放血解剖和分离培养，方法均同试验组。
2 结果
2.1 发病情况 1～8组试鼠在饮菌3d后，逐渐出现不同程度烦燥、互相撕咬，大部分雄性鼠阴囊咬伤，红肿、结痂，雌性鼠尾部咬伤红肿糜烂，接着出现精神萎糜，弓背竖毛，卷宿多睡，行动迟缓，触摸反应迟钝，毛色失去光泽呈干枯样，饮食减少（从原来每天平均每鼠饮水6.9ml减少到5.6ml，饲料由4.8g减至4.0g），但无腹泻。解剖发现皮下淋巴无充血肿大，部分鼠肺有不同程度充血呈粉红色浸润，肝贫血苍白不大，未见到有散在针尖状白色小结节，脾比正常大2～3倍，肾轻度水肿。
2.2 F 2 株培养 肝、脾压印直接培养均阴性;肝、脾经增菌10d、20d、30d转YSA培养基划线均阴性，而其它脏器经增菌10d、20d、30d转YSA培养基划线分离出8株目标菌（胃部5株、回盲部3株）。见表1。表1 32只实验小白鼠感染F 2 株检测结果（略）
2.3 抗体检测 试验组32只鼠中除其中1只注射FeSO 4 饮菌后饲养到30d查血清抗体阳性外，其余鼠血清查抗体均阴性。
2.4 对照组 皆无腹泻、精神萎糜、食欲减少、行动迟缓、毛色失光泽等症状;解剖时未见肺充血、肝苍白肿大、脾肿大;直接压印和增菌培养均没有找到目标菌，且血清查抗体亦都阴性。
3 讨论
本实验证实F2株经口饮菌对小白鼠有侵袭性，发病但不致死，说明毒力不强。32只小白鼠分别饮菌3～8d，仅从8只鼠分离到菌株。说明大部分试鼠在机体免疫系统作用下有吞噬清除作用，个别产生抗体。有5只试鼠在饮菌停止转换饮水6～48h从胃内容物分离出菌株，说明该菌能在胃酸中存活最少48h。有3只试鼠从回盲部分离出菌株，分析F2菌是从消化道移动到的。因为未有从肝、脾、淋巴、肺这些脏器分离到菌株，说明F2株不能产生菌血症，因假结核血清型目前已知11型、1～5型有致病性 ［1］ ，其它为条件致病菌。但菌体进入机体刺激机体反应后，菌体大多数受损或死亡而渗出毒素对机体造成一定程度的损害呈慢性过程，使正常生理机能受损表现出各种症状和体症。解剖未见肝、脾有白色针尖状小结节，但肝呈贫血样、脾大2～3倍、肺部充血、精神状态变差、饮食减少、身体消瘦，这些情况说明假结核菌是有一定毒素的，人们应提高认识加强防治。
本试验感染鼠10d玻片法未能查出抗体，30d才能查出抗体，与本地区检出假结核血清阳性一致 ［2］ 。说明本地区是有假结核菌存在。但作病原学检查用1/20万龙胆紫1%溶解血赫氏选择敏感培养基培养1000份鼠肝、脾脏均未能分离到假结核菌。当然动物在自然界不可能象实验室一样长时间纯菌饮食，动物间的易感性和抗性同时存在，在非暴发流行期间或个体非急性感染时是比较困难分离到菌株的。本试验提示在分离假结核菌时应以机体消瘦、毛色失光泽等症状和解剖时见脾大明显以及肝、脾有白色针尖状小结节者 ［3］ 为重点检查对象。取材应以胃和回盲部内容物为主，放改良PBS置4℃增菌后在10～30d内划平皿分离较为理想 ［4］ 。
参考文献:
［1］顾峰，张贵斌，张贵军.假结核菌血清学分型与其来源及病源性关系研究现况［J］.中国地方病防治杂志，2004，19（3）:156～158.
［2］刘小华，杨华源，梁秋光，等.湛江市人和动物假结核病血清学调查［J］.中国人兽共患病杂志，1997，13（5）:69.
［3］于恩庶.福建假结核菌的抗原分析［J］.中国兽医科技，1986（2）:9 ～12.
［4］张贵军，顾峰，曹淑兰，等.病源性耶尔森氏菌在磷酸盐缓冲液中的低温生长［J］.中国地方病防治杂志，2003，18（2）:88～89.
基金项目:广东省医学科学技术研究基金项目（No.A2004718）
作者单位:广东省湛江鼠疫防治研究所，广东湛江 524037.
作者简介:曾敏（1962～），女，主管医师，主要从事鼠疫防治研究.
收稿日期:2005-04-10