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摘要:目的 建立亚马逊利什曼原虫无鞭毛体体外培养方法，并用间接免疫荧光法分析其抗原特异性。 方法 小鼠皮损组织处获得的无鞭毛体（Al）、由前鞭毛体转化来的无鞭毛体（Ap）、J774.G8巨噬细胞来源的无鞭毛体（Aj）置于改良后的Schneider's Drosophila培养基，pH4.6、33℃条件下培养，取培养物光镜下观察并用间接免疫荧光法分析。 结果 三种不同来源无鞭毛体体外培养物光镜检查形态相似，均与纯培养获得的无鞭毛体一样。与无鞭毛体特异性蛋白P-8和P-4特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光分析显示，三种不同来源的无鞭毛体均出现阳性，且浓度与部位相似。而前鞭毛体与抗P-8单克隆抗体（mAb）染色呈弱阳性反应，与抗P-4单克隆抗体呈阴性反应。相反，GP-46/M-2McAb与前鞭毛体染色呈强阳性反应，与无鞭毛体仅呈弱阳性反应。 结论 在33℃条件下，用改良的Schneider's Drosophila培养基进行无鞭毛体体外培养获得成功。用阶段特异性单克隆抗体，进行间接免疫荧光分析法可鉴定亚马逊利什曼原虫的无鞭毛体。
关键词:亚马逊利什曼原虫;无鞭毛体;体外培养;间接免疫荧光
Axenic cultivation and indirect immunofluorescent analyasis of Leishmania anazonesis amastigotes.
WANG Hua-min，Soong Lynn.
（Division of Microbiology and Immunology of Hainan Medical College，Haikou571101，Hainan，P.R.China;Department of Microbiology and Immunology，University of Texas Medical Branch，Galveston，TX，USA）
Abstract:Objective To establish a method for culture of Leishmania amazonensis amastigotes in vitro and identify the anti-genic specificity of amastigotes with indirect immunofluorescent assay. Methods Amastigotes derived from mouse lesions，infected J774.G8macrophages，or promastigotes，were cultured in modified Schneider's Drosophila medium under pH4.6and33℃.The cultured amastigotes were observed by light microscope and analyzed with indirect immunofluorescent assay. Results Three differ-ent sources of amastigotes analyzed by light microscope showed similar morphological features.Indirect immunofluorescent analyses employing mAbs specific to amastigote proteins P-4and P-8indicated positive staining for all three types of amastigotes with similar intensity and localization pattern.Anti-P-8but anti-P-4mAb showed weak staining for promastigotes.In contracst，GP-46/M-2mAb was reactive strongly to promistigotes but weak staining for amistigotes. Conclusion Under33℃，amastigotes were cultured successfully using modified conditions，and Leishmania amazonensis amastigotes can be identified with indirect immunofluo-rescent analysis by employing stage-specific mAbs.
Key words:Leishmania amazonensis;Amastigotes;Culture in vitro;Indirect immunofluorescent assay
亚马逊利什曼原虫是墨西哥利什曼原虫成员之一，可引起皮肤利什曼病、弥漫性皮肤利什曼病及粘膜利什曼病。与其他利什曼属一样，亚马逊利什曼前鞭毛体能在体外连续培养，而无鞭毛体体外培养成功的报道甚少 ［1～3］ 。无鞭毛体不论是从皮损的组织中获得，还是从感染的巨噬细胞获得，其数量均有限而且很费时，还污染有宿主细胞成分 ［4］ 。为了获取大量的无鞭毛体供免疫学及生物学研究，在通过改良方法于体外将前鞭毛体转化为无鞭毛体并在体外持续纯培养获得成功。本文对经体外转化的无鞭毛体进行形态学及特异性抗原的鉴定。结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 皮损组织处获得无鞭毛体（Al） 无鞭毛体从皮损的组织中获得，作为原虫的原代，经体外培养后逐渐使之适应为纯培养的无鞭毛体。培养无鞭毛体的培养基:Schneider's Drosophila加20%FBS加Cystin（Sigma）、L-tyrosin（Sigma），培养温度 33℃。完全培养基存放于4℃不超过3～4周。
1.2 前鞭毛体转化为无鞭毛体（Ap） 前鞭毛原虫株（MHOM/BR/77/LTB0016）于Schneider's Drosophila medium（GIBCO，Grand Island，NY）中23℃培养，培养基pH7.2，含20%FBS（56℃加热70min灭活），庆大霉素（50μg/ml）及酵母（auto-yeast）（Sigma）。来源于前鞭毛体的无鞭毛体（简称为Ap）的转化:在首次转化中须将FBS的浓度增加至50%。当原虫浓度达1×10 7 ～2×10 7 /ml.时须传代一次，以便使无鞭毛体维持正常形态。
1.3 J774G8巨噬细胞来源的无鞭毛体（Aj） 巨噬细胞J774G8用含10%FBS（30min灭活）IMDM（GIBCO，Grand Island，NY）在5%CO 2 ，37℃的培养箱中培养。当培养至指数阶段时收获细胞，并调节细胞数至2×10 5 细胞/ml置于15mm的培养皿（Becton Dickinson，USA）中培养。当细胞数覆盖平面50%～60%时，用于原虫感染。原虫在平台期（稳定期）时可用于感染J774G8巨噬细胞，比例为10:1，感染细胞在组织培养瓶（Fal-con），在33℃，5%CO 2 及95%湿度的培养箱中培养12h，未被内吞原虫的巨噬细胞用纯IMDM培养基洗掉，而已内吞了原虫的J774G8巨噬细胞则在完全培养基中再培养72～96h。分离的细胞用0.5%tyrosin（Sigma）处理，混合3～5min之后用完全Schneider's Drosophila培基（含20%FBS pH5.2）用25号针头注射器通过制成匀浆，匀浆悬液经800rpm离心3min，再1000rpm5min离心以除去宿主细胞残渣，2500rpm10min离心沉淀后得到大量的原虫。原虫悬液（初浓度为10 6 /ml）于前述的无鞭毛虫培养基于33℃中培养，当达到平台期时收获即得J774G8巨噬细胞来源的无鞭毛虫（简写为Aj）。
1.4 单克隆抗体 本文所用的单克隆抗体（McAb）P-4，P-8及GP-46/M-2由Pan和Mcmahon-pratt惠赠 ［5，6］ 。
1.5 间接免疫荧光染色方法 用PBS洗涤原虫2次并调节浓度为5×10 6 /ml，然后滴加于12孔玻片上自然风干（Cel-Line Associates，INC.Newfield，NJ），2～3d内用于荧光染色镜检。在荧光检测时，原虫用6%parafarmaldehyde（Electron Microscopy Sciences，）固定2min，然后在抗体孵育之前用封闭液（0.05Tri-ton×100，0.5%Cascin，1%山羊血清）1h，特异McAbs（P-4，P-8及GP-46）稀释成1:300，然后置4℃孵育过夜;洗涤后用荧光标记的抗鼠IgG（Fab特异）（Sigma）室温孵育45min，洗涤后，用盖玻片胶封（Bromeda Corp.）。用正常鼠血清和/或二抗作对照，用ZEISS Axiophot2荧光检测。
2 结果
2.1 原虫培养及形态学检测 从BACB/c感染小鼠皮损部位获得的原虫置于Schneide's培养基+20%FBS，pH7.2、23℃中培养可得到鞭毛体。若将皮损处获得的原虫置Schneide's培养基+20%FBS，pH5.1、33℃，前鞭毛体可转化为无鞭毛体，但只在体外维持3代。将FBS提高到50%，无鞭毛体就可在培养基中稳定传代。稳定期的前鞭毛体用于传代无鞭毛体，并产生大量的稳定期无鞭毛体，这种从前鞭毛体转化为无鞭毛体的生长期与皮损来源无鞭毛体相似。3种来源的无鞭毛体经光镜检查显示形态与特征相近。所有3种无鞭毛体形式与纯培养的一样，无鞭毛、圆形，无鞭毛体（图1）的Giemsa染色形态学与前鞭毛体（简写为P）明显不同。
2.2 原虫的抗原特性 通过间接免疫荧光检测，不同来源的无鞭毛体可被相应的mAb、P-4、P-8特异识别而前鞭毛体则不被识别，3种来源的无鞭毛体经单克隆抗体（McAb）P-4，P-8染色阳性，而且三种无鞭毛体均浓度及部位相似。前鞭毛体用P-8，McAb染色显示弱阳性。相反，用GP-46/M-2染色显示与前鞭毛体强阳性反应，而与无鞭毛体为弱阳性反应。
3 讨论
亚马逊利什曼原虫可引起各种临床疾病，包括皮下损害、弥散性皮损、粘膜下损害等。与其他一些利什曼原虫，其前鞭毛体能在体外连续培养，而无鞭毛体在体外传代有限。无鞭毛体不论是从皮损的组织中获得，还是从感染的巨噬细胞获得，其数量均有限、产量低，且获得无鞭毛体的程序通常很费时、污染有宿主细胞成分 ［1～3］ 。有学者认为改变培养条件可以促使前鞭毛体转化为无鞭毛体，但不同的利什曼原虫其培养温度、pH值、小牛血清浓度有所不同 ［4］ 。
图1 亚马逊利什曼原虫Giemsa染色形态学（×1000）（略）
P表示前鞭毛体:在24℃，pH7.2.中培养;Al、Ap、Aj分别表示动物模型的皮损来源、前鞭毛体转化、巨噬细胞株J774.G8来源的无鞭毛体:在33℃，pH5.1中培养。
注:图上显示经Giemsa染色的寄生虫的大小及形态
为了获取大量的无鞭毛体供免疫学及生物学研究，我们通过改良方法在体外将前鞭毛体转化为无鞭毛体并在体外纯培养，并对3种来源的无鞭毛体进行鉴定，本文通过特异单克隆抗体的间接免疫荧光染色对不同来源无鞭毛体及前鞭毛体进行染色检测原虫特异性抗原的表达。结果显示，三种无鞭毛体均可与P-4，P-8单克隆抗体反应，出现强的荧光染色，其强度及部位形式均相似，而前鞭毛体仅与P-8单克隆抗体有较强的阳性反应。而GP-46/M2与前鞭毛体（P）呈强阳性反应，而不与无鞭毛体（A）出现强阳性反应。因此，通过特异单克隆抗体鉴定之后，可以对三种无鞭毛体从蛋白抗原水平进行鉴定。说明三种无鞭毛体的特性是一致的。三种来源中，动物皮损来源有限，不易获得大量无鞭毛体，而前鞭毛体感染巨噬细胞（MΦ）来源的无鞭毛体，因含有大量宿主细胞巨噬细胞成分，而通过改良法获得的无鞭毛体具有的优点是克服其它两种无鞭毛体的弱点而获得大量的无鞭毛体，从而解决了在研究中需要大量无鞭毛体的问题。
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