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摘要:目的 探讨双试剂双缩脲法在全自动生化仪中直接测定脂肪乳浊标本血清总蛋白。 方法 将单试剂双缩脲法改成双试剂，在全自动生化仪上采用二点终点法直接测定。 结果 双试剂双缩脲法测定脂浊血清标本的总蛋白为（74.27±5.65）mmol/L与手工标化法测定的（74.46±5.77）mmol/L差异无显著性（P>0.05）。 结论 双试剂双缩脲法能有效地消除脂肪的干扰，无需另进行手工除脂测定，大大地提高工作效率。
关键词:双试剂;双缩脲法;血清总蛋白;脂浊标本
Determination of total serum from fat blood specimens by using biurea and double reagents.
XIE Zhen-ji，LUO Qiao-zhuang，ZHOU Shao-qing.
（Fanyu District Dashi Hospital of Guangzhou City，Guangzhou511430，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To discuss the biurea method for determination of total protein in serum of fat emulsion specimens with double reagents on the automated biochemical analyzer. Methods The single reagent biurea reaction was altered to the double reagent and direct determination was performed by using the two-end-point method on the automated biochemical analyzer. Re-sults There were no marked differences between the double reagent reaction and biurea manual standard reduction. Conclusion The interference of the fat can be effectively eliminated by double reagent biurea reaction without need to carry on manual determina-tion of fat，Thus the working efficiency is greatly enhanced.
Key words:Double reagent;Biurea method;Total protein
随着人们生活水平及健康意识的提高，个人和集体健康体检很为普遍，脂血标本也越来越多。对高脂血标本，常规双缩脲法（即单试剂法）在全自动生化仪中测定无法彻底消除脂质干扰，使结果远高于真值，准确性差，需要手工除脂进行测定，延长报告时间，也增加了劳动量，效率低下。为此试用改良双缩脲双试剂法对血清总蛋白质直接测定进行探讨，现分析如下。
1 材料与方法
1.1 标本 取自2005年3月～2005年5月间日常中集体单位体检及门诊病人的脂肪乳浊标本。共54例，其中男性30例，女性24例，年龄18～65岁;正常标本75例其中男性41例，女性34例，年龄16～62岁。
1.2 仪器 东芝TAB-40FR全自动生化仪;德国ECOM-F6124半自动生化仪;芬兰加样移液器。
1.3 试剂
1.3.1 6mol/L NaOH溶液和6mol/L KOH溶液按常规方法配制。
1.3.2 双缩脲试剂 按Doumas配方 ［1］ 称取未失结晶水的硫酸铜（CuSO 4 ·5H 2 O）3.0g，溶于500m1新鲜蒸馏水中，加酒石酸钾钠（NaKC 4 H 4 O 6 ·4H 2 O）9.0g，碘化钾（KI）5.0g，待安全溶解后，加入6mol/L氢氧化钠溶液100ml，最后加蒸馏水至1L。室温贮存在密闭的聚乙烯瓶里，约稳定6个月。
1.3.3 双缩脲空白试剂 除不含硫酸铜外，其余成分与双缩 脲试剂相同。
1.3.4 改良双缩脲双试剂 R1:取10ml6mol/L KOH溶液，加水稀释至100ml，另加表面活性剂-聚乙二醇基苯基醚（Trition X-100）50μl。R2:浓缩5倍的双缩脲试剂。即称取CuSO 4 ·5H 2 O3g溶于新鲜制备的蒸馏水中，加入酒石酸钾钠9g和KI5g，待完全溶解后，在搅拌下加入6mol/L KOH溶液20ml，并用蒸馏水稀释至200ml。
1.3.5 总蛋白标准液及质控 罗氏标准液（批号:164690-01）;罗氏质控（批号:167326-03）。
1.4 方法
1.4.1 双缩脲法手工标化测定 ［2］ 测定管（M）、标准管（S）、试剂空白管（RB），分别加入血清、蛋白标准、蒸馏水各50μl加双缩脲试剂5.00ml;另取标本空白管（B）加入双缩脲空白试剂及血清50μl，混匀置（25±1）℃30min，之后各管加3.00ml乙醚抽提，在波长546nm处比色，用蒸馏水调零，测各管吸光度。计算:血清总蛋白（g/L）=AM-ARB-AB/AS-ARB-AB×标准浓度。
1.4.2 双缩脲双试剂直接测定 主要分析参数:两点终点法，温度37℃，主波长548nm，副波长660nm，A1读时间［15］-［16］，A2读点时间［60］-［62］，计算:AM-AR/AS-AR×标准浓度。
1.4.3 双缩脲常规单试剂测定 主要分析参数:一点终点法，计算:AM/AS×标准浓度。
1.4.4 统计处理分析 采用SPSS ver.11.5软件进行统计和配对资料t检验，实验结果以x±s表示;用Microsoft Excel软件进行线性相关与回归分析作图。
2 结果
2.1 结果显示:正常标本中，单双试剂两方法比较均无统计学差异;但在脂血标本中，除手工标准法与双试剂直接法无统计学差异（P>0.50）;手工标准法与常规单试剂法结果在统计学中差异呈显著性（P<0.001）。见表1。
表1 三种方法测定血清总蛋白的结果（略）
注:*与手工标准法比较，P<0.01。
2.2 相关回归线性分析显示 脂肪乳浊标本中，手工标准法与双试剂直接法的线性回归系数达0.9935，而手工标准法与常规单试剂法的线性回归系数仅为0.8687。见图1～3。
图1 脂血标本之标化法与双试剂法比较（略）
图2 脂血标本之标化法与单试剂法比较（略）
3 讨论
3.1 在双缩脲双试剂中用KOH代替NaOH按Doumas配方配制，因为用NaOH配制的双缩脲试剂（BR）在遇到某些高脂血清时于540nm处产生内源性吸光度而产生正干扰.如延时比色，各型高脂血清均可使NaOH-BR的显色逐渐产生程度不等的 混浊，且可见絮状物 ［3］ ;在实验中发现，于R1中加入适量乳化剂-OP（聚乙二醇基苯基醚），既能稳定吸光度变化，又能降低样品空白的吸光度，一般可降低1/4左右。与加入硫酸钠作为稳定剂相比，可以避免在加入R2后SO4+浓度对实验过程的影响 ［4］ 。这些措施都能有效地扣除各型脂血引起的干扰，取得满意的实验结果。
图3 正常标本单双试剂法比较（略）
3.2 手工标准法与双试剂直接法无统计学差异（P>0.50），且两者结果的线性回归系数达0.9935。表明双缩脲双试剂直接测定法适用于在全自动生化仪中使用。这与相关文章报道的相符 ［4］ 。
3.3 双缩脲双试剂法测量血清总蛋白之所以难易推广，究其原因，在于双缩脲反应的呈色时间。1981年Doumas经进一步论证，确定为（25±1）℃60min或（37±1）℃10min，并认为只有当反应完全时，才能有最佳的准确度和精确度 ［5］ 。但实际上，在反应进行至5min时，低值血清吸光度已基本稳定，仅极少量高值血清蛋白到30min吸光度才趋于稳定。双缩脲双试剂法测量血清总蛋白时从反应到读点时间虽仅510s，不足够10min，但从反应趋势曲线可看出后期所增加的吸光度已有限，影响很小了。
综上所述，双缩脲双试剂法直接测定血清总蛋白能很好地消除脂浊的干扰，与手工标化法比较结果无统计学差异。双试剂直接法无需除脂方便快捷，结果能为临床接受，值得推广，尤其是饮食部门的集体单位体检。
参考文献:
［1］Doumas BT.Standards for total serum protein assays-a collaborative study［J］.Clin Chem，1975，21:1159.
［2］叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程［M］.第2版.南京:东南大学出版社，
［3］赵丽丽，孟泽.不受高脂血症影响的双缩脲试剂［J］.临床检验杂志，1993，11（1）:4～5.
［4］王凤学，李树仁，欧阳旭红.血清总蛋白双试剂双缩脲法消除脂浊和胆红素的干扰［J］.临床检验杂志，2000，18（4）:202～204.
［5］Doumas BT，Bayase DD，Carter RJ，et al.A Condidate reference method for determination of total protein in serum I［J］.Clin Chem，1981，27（10）:1159.