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The use of RNAi technology against cirosis.HU Yi，YUAN Shi-shan.
（Department of Biochemistry of Hu-nan Normal University Medical Collge，Changsha410006，Hunan，P.R.China）
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是多种生物体内由双链RNA介导的同源mRNA降解现象。它首先是在1990年由Jor-gensan R等 ［1］ 在矮牵牛花的研究中发现的。他将紫色色素合成酶基因导入矮牵牛花以加深花色，结果不仅未加深颜色，反而使许多花呈现杂色甚至白色。Jorgensan把这种现象称为“共抑制”（Cosuppression）。随后人们在以线虫为材料的实验中发现强烈而且特异的基因表达抑制是由dsRNA介导产生的 ［2］ 。由于当时不清楚为何dsRNA会产生此作用，所以Fire等 ［3，4］ 将这种由dsRNA引发的特定基因表达受抑制的现象称为RNAi。随着研究的逐步深入，人们认识到RNAi是自然界普遍存在的一种古老的保护机制。它是生物体在基因水平上的一道防线，使基因组免受核酸“侵略者”如病毒、转座因子等的损害 ［5］ 。因此，可以说RNAi是基因组的免疫系统。
RNA干扰技术具有高效性和高度的特异性 ［6］ ，因此，它在基因治疗方面的应用具有很大的潜力，尤其是在抗病毒感染方面。而病毒性疾病是一种严重危害人类身体健康的疾病。传统的病毒性疾病治疗多采用接种疫苗或以病毒特意性蛋白为靶点进行药物治疗，但是这些方法并不能直接清除体内的病毒，而且许多病毒具有高度变异性，这给病毒性疾病的防治带来了很大的困难。
近年来，RNA干扰机制的研究进展迅速，使RNA干扰技术作为一种临床治疗手段成为可能，从而为各种病毒性疾病的治疗开辟了一条崭新的途径。
1 RNAi的作用机制
RNA干扰包括起始阶段和效应阶段。在起始阶段，导入的dsRNA首先在Dicer酶的降解下形成21～23核苷酸长度的小干扰RNAs（siRNAs），每个siRNA的3'端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA结合到核糖核苷酸酶复合物上形成RNA诱导的基因沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）。该复合体依赖ATP释能而解聚siRNA双链成单链以激活RISC，激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3'端12个碱基的位置切割mRNA，导致基因沉默效应。
2 siRNA的设计与构建
2.1 siRNA的设计 研究发现，对哺乳动物细胞最有效的siR-NAs是21～23个碱基大小且3'端有两个突出碱基的双链RNA;而对非哺乳动物，比较有效的是长片段dsRNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会 显著削弱基因沉默的效果。在选择靶位点时，不要针对5'和3'端的非编码区（Untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的干扰效果。
2.2 siRNA的构建 构建siRNA的方法有很多，主要包括5种:①体外化学合成。在体外合成相应序列的RNA片段，退火形成双链，转入体内。尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的—研究人员几乎不需要做什么工作。许多生物技术公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点是价格高，定制周期长。②体外转录法。即合成相应的DNA链，在体外转录成相应的RNA。这样的成本相对化学合成法而言比较低，是一种性价比较高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。③用RNase III消化长片断双链RNA制备siRNA。其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法—制备一份混合有各种siRNAs“混合鸡尾酒”就可以避免这个缺陷。这个方法是选择通常是200～1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA，然后用RNase III（or Dicer）在体外消化，得到一众siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。④构建siRNA表达载体，转入细胞或体内表达成小发夹RNA（shRNA），在Dicer酶的作用下形成siRNA。siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法—带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有助于富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。⑤PCR法。利用PCR的方法是特异性启动子与表达目的片段连接，直接将PCR产物转染入细胞，在细胞内此产物可以直接转录出相应的siRNA或者shRNA。此种方法比较经济便捷。
沉默效果地评价，一方面需通过基因功能地改变来评价，另一方面需检测基因表达水平。常规地RT-PCR，Northern blot，免疫组化，及Western blot等方法用于目的基因mRNA和蛋白水平表达抑制地检测，但在定量检测上仍有一定地局限性。于是人们进一步采用实时定量RT-PCR，流式细胞技术（Flow cytometry）和激光共聚焦等方法进行检测，大大提高了结果地客观真实性。
3 RNA干扰技术在抗病毒方面的研究
目前，RNA干扰技术在抗病毒方面的研究主要集中在抗HIV，HBV，HCV的研究上，也有一些抗植物病毒方面的报道。最近，将RNA干扰技术用于对SARS病毒的防治的研究也获得了突破性进展。
3.1 RNA干扰技术在抗HIV方面的研究 HIV基因组中的许多位点都可以作为siRNA作用的靶位点，目前的研究主要集中在nef、tat基因及HIV-1的辅助分子的相应基因。Omoto S和Fujii Yr ［7］ 利用HIV-1感染的细胞直接制备nef miRNA并将其导入受HIV-1感染的人T细胞，结果使HIV-1基因组的转录下调。Ming-Ta M.Lee等 ［8］ 构建了可稳定表达针对HIV-1tat基因的siRNA的载体，并将其导入培养细胞。结果证明，这些载体可使细胞选择性的降解病毒mRNA从而使细胞免于HIV-1的感染。Anderson J等 ［9］ 构建了可表达针对CXCR4和CCR5的两个小发卡siRNA的载体。CXCR4的载体中有U6启动子，CCR5的载体中有H1启动子，然后导入细胞。结果使目的细胞获得了对X4和R5HIV-1的抗性。因此稳定而长期的使细胞表面受体分子下调可作为一种有效的抗HIV-1的基因疗法。Suhasini Modem等 ［10］ 研究发现Sam68在功能上补充并加强HIV-1Rev蛋白在Rev介导的基因表达和病毒的复制中的作用。他们将siRNA导入Hela细胞从而得到了Sam68稳定敲除的Hela细胞（SSKH），同时发现细胞中的HIV-1的复制也得到了抑制。
最近研究发现，HIV等反转录病毒的复制与生物体内的反转录转座子有关（比如酵母的Ty反转座子）。酵母的Ty反转座子是通过形成套索样中间体的方式来进行cDNA的复制的。Ying Ye等 ［11］ 假设HIV-1也会形成一个套索样中间体，因此用siRNA抑制人的RNA套索样中间体去分枝酶（RNA lariat de-branching enzyme，DBR1）同时可以抑制HIV的复制。他们设计了3个针对DBR1的siRNA，导入细胞后使DBR1的表达降低了80%。在对宿主细胞没有明显影响的情况下抑制了HIV-1的复制。因此，编码DBR1的序列可用作抗HIV-1的研究。
应该注意的是，在HIV感染的细胞过程中发挥辅助作用的细胞因子往往在正常细胞的转录、翻译以及免疫调节中也由重要作用。因此在选择HIV-1的辅助分子作为siRNA的靶位点是应衡量其利弊。
3.2 RNA干扰抗HBV的研究进展 Zhu C等 ［12］ 设计了pSi-lencer3.1-H1hygro质粒载体用以表达针对HBV S基因的siR-NA。通过脂质体法将质粒转入细胞内。通过检测HbsAg和HbeAg来确定病毒的表达情况，并通过FQ-PCR（fluorogenic quantitative PCR）方法和半定量RT-PCR法分别对病毒基因组DNA和S-mRNA进行检测。结果表明，当HBV S-siRNA导入量分别是1μg，2μg和4μg时，HbsAg的表达量降低了75%， 82%，89%;HbeAg的表达量降低了32%，38%，43%;HBV DNA的复制产物降低了30%，43%，49%;HBV S-mRNA含量降低了30%，70%，90%。结果说明RNAi可有效的抑制HBV在感染细胞中的复制和其抗原的表达，而且抑制效果和siRNA的量呈正相关。在HBV引起肝癌的研究中Chan DW，Oi-Lin Ng I ［13］ 构建了可表达针对HBV X（HBx）的shRNA的表达载体，并将其导入PLC/PRF/5HCC细胞中。结果显示RNAi可有效的降低HBx mRNA的转录和蛋白的表达而且PLC/PRF/5HCC细胞的分裂也被很大程度的抑制了。进一步试验证明针对HBx的RNA干扰治疗可抑制肿瘤在裸鼠体内的增长。
3.3 RNA干扰抗HCV的研究进展 Prabhu R等 ［14］ 分别构建了三个质粒表达载体，可表达针对病毒结构基因（E2），非结构基因（NS3，NS5B）的siRNA。通过Western blot和Immunocyto-chemical staining分析，这三个siRNA都可有效的抑制HCV核蛋白和NS5A蛋白的表达。结果说明RNAi是一种有效的抑制HCV表达和复制的方法，而且此方法具有选择性。
3.4 RNA干扰技术在抗SARS方面的研究 目前SARS的阴云已经退去，已经没有必要再用疫苗或特殊的抗病毒疗法来对付SARS了。但是为人们公认的是应该有一种对付SARS冠状病毒的特效药物以预防SARS将来可能对人类的突然袭击 ［15］ 。目前SARS病毒致病的分子机制尚不清楚，从而阻碍了SARS特异防治的深入研究。由于siRNA在干扰病毒复制的同时并不会导致感染细胞发生明显的损伤，因此siRNA有望成为抗SARS病毒感染的新工具。军事医学科学院微生物流行病研究所的赵慧等 ［16］ 针对BJ01株SARS冠状病毒复制酶基因（Pol）和刺突蛋白基因（S）设计了4个siRNA，并用间接免疫荧光法及实时定量反转录PCR法检测所设计的siRNA对SARS冠状病毒复制的抑制作用。结果表明针对Pol基因的siRNA在Vero细胞中可阻断BJ01株SARS病毒的复制及其蛋白的表达。
中国工程院院士钟南山近期宣布，有关SARS特效药的研究取得令人振奋的突破性进展，目前已在恒河猴（俗名猕猴）身上试验并获得成功，证明小干扰核酸药物对SARS冠状病毒具有明显的治疗和预防作用。研究人员选取了5组共20只恒河猴进行实验，先通过滴鼻方式让它们感染SARS病毒，再用同样方式输入药物。在恒河猴出现SARS的典型症状:高热、食欲不振等后，接受siRNA药物治疗。治疗后，恒河猴病毒复制量减少了75%，病猴肺部的损伤明显减轻，而且随剂量增加，疗效进一步改善。而在感染前接受药物预防的猴子，体温上升和肺部损伤均明显减轻，证明药物预防起效。目前研究结果表明，siRNA药物对SARS冠状病毒具有明显的治疗和预防作用，而且没有明显副作用 ［17］ 。
3.5 RNA干扰技术在抗其他病毒性疾病的研究 A型流感病毒是在人群中流行最为广泛的一种。目前疫苗是我们采取的主要预防措施，但只能使70%～90%的小于65岁的健康成人免于感染。对于老人，儿童和免疫力低下的人这种概率要低很多。目前有4种药物被FDA批准用于流感的预防和治疗，但是这些药物副作用大而且容易是使病毒产生抗性。Thomas M等 ［18］ 利用针对流感病毒保守区的siRNA抑制了流感病毒在鸡胚和细胞中的复制。Zhou Y等 ［19］ 利用转基因烟草得到了针对流感病毒H1N1亚型非结构蛋白NS1的mRNA的siRNA，用其转染哺乳动物细胞，使病毒的复制得到了显著得抑制。
Li YC等 ［20］ 构建了三个质粒表达载体，可以表达针对流感病毒H5N1型的编码核蛋白的基因序列。根据siRNA阻止目的基因的表达和抑制病毒导致的细胞凋亡效果，来评价siRNA的作用。通过Northern blot and western blot分析，结果显示，从三种质粒得到的shRNA对病毒核蛋白基因的表达有明显的抑制作用，同时可以阻止病毒感染导致的细胞凋亡。说明RNAi疗法作为治疗禽流感的一种新方法具有很大的潜力。
人类疱疹病毒感染可以导致严重的疾病，同时也是HIV感染的一个协同因素。Palliser D等 ［21］ 用针对HSV-2的UL27和UL29基因的siRNA与脂质的混合物，灌注小鼠阴道，使小鼠免于致死性感染，说明siRNA可作为杀菌剂用于防止病毒的转播。
4 问题与展望
首先，并不是所有的病毒RNA都适合作为siRNA的作用靶。一些病毒RNA可形成复杂的空间结构从而使siRNA无法起到干扰作用。还有一些病毒RNA与蛋白质结合，同样可使靶序列被封闭。
其次，在我们应用siRNA进行治疗时，病毒会产生大量的变异体以逃避siRNA的干扰作用。Atze T.Das等 ［22］ 在研究中发现，针对HIV-1nef的siRNA在长期的治疗中未必有效。他们把针对nef序列的siRNA导入HIV-1感染的可大量繁殖的Sup T1细胞株，培养8个月后进行检测，结果表明胞内HIV-1的拷贝数没有明显的减少。进一步研究表明胞内HIV-1的nef序列发生了突变，从而使siRNA起不到干扰作用。因此，这就要求我们在应用RNAi方法时要采用针对病毒保守区的多个siRNA同时进行作用。另外，一些细胞因子对病毒抗RNAi作用也有贡献。ADAR1是第一个被发现的RNAi调控因子。因为siRNA可以作为一些细胞正常基因的小分子抑制物，细胞要维持生存必须发展一种机制以抵抗RNAi的负作用 ［23］ 。
最后，机体对外来基因干预的排斥以及siRNA本身的毒性也时RNAi用于临床的一大障碍。因此，要将RNAi技术真正用于临床疾病的治疗，还需要进一步的研究。
参考文献:
［1］ Napoli C，Lemieux C，Jorgensen R.Introduction of a chalcone synthase gene into Petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans［J］.Plant Cell，1990，2:279～289.
［2］Tabara H，SarkissianM，Kelly WG，et al.The rde-1gene，RNA interfer-ence，and transposon silencing in C.elegans［J］.Cell，1999，99（2）:123～132.
［3］Fire A，Xu S，MontgomeryMK，et al.Potent and specific genetic interfer-ence by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391:806～811.
［4］Timmons L，Fire A.Specific interference by ingested dsRNA［J］.Nature，1998，395:854.
［5］Buchon N，Vaury C.RNAi:a defensive RNA-silencing against viruses and transposable elements［J］.Heredity，2006，96（2）:195～202.
［6］ Yokota T.Uirusu.Gene therapy of virus replication with RNAi.2005，55（1）:1～7.
［7］ Omoto S，Fujii YR.Regulation of human immunodeficiency virus1tran-scription by nef microRNA［J］.J Gen Virol，2005，86（Pt3）:751～755.
［8］Lee MM，Coburn GA，McClure MO，et al.Inhibition of Human Immunode-ficiency Virus Type1Replication in Primary Macrophages by Using Tat-or CCR5-Specific Small Interfering RNAs Expressed from a Lentivirus Vector［J］.J Virol，2003，77（22）:11964～11972.
［9］Anderson J，Akkina R.HIV-1resistance conferred by siRNA cosuppres-sion of CXCR4and CCR5coreceptors by a bispecific lentiviral vector［J］.AIDS Research and Therapy，2005，2:1.
［10］Modem S，Badri KR，Holland TC，et al.Sam68is absolutely required for Rev function and HIV-1production［J］.Nucleic Acids Res，2005，33（3）:873～879.
［11］Ye Y，De Leon J，Yokoyama N，et al.DBR1siRNA inhibition of HIV-1replication［J］.Retrovirology，2005，2:63.
［12］Zhu C，Fan XG，Li N，et al.Inhibition of hepatitis B virus replication and expression by RNA interference in vitro［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2005，85（35）:2503～2506.
［13］Chan DW，Oi-Lin Ng I.Knock-down of hepatitis B virus X protein re- duces the tumorigenicity of hepatocellular carcinoma cells［J］.J Pathol，2006，208（3）:372～380.
［14］Prabhu R，Vittal P，Yin Q，et al.Small interfering RNA effectively in- hibits protein expression and negative strand RNA synthesis from a full-length hepatitis C virus clone［J］.J Med Virol，2005，76（4）:511～519.
［15］ Wu CJ，Chan YL.Antiviral applications of RNAi for coronavirus［J］.Expert Opin Investig Drugs，2006，15（2）:89～97.
［16］赵慧.siRNA对SARS冠状病毒复制的抑制作用［J］.中国生物化学与分子生物学报，2005，21（3）:397～402.
［17］Li BJ，Tang QQ，Cheng D，et al.Using siRNA in prophylactic and thera-peutic regimens against SARS coronavirus in Rhesus macaque［J］.Nature Medicine，2005，11:944～951.
［18］Thomas M，Ge Q，Lu JJ，et al.Polycation-mediated delivery of siRNAs for prophylaxis and treatment of influenza virus infection［J］.Expert Opin Biol Ther，2005，5（4）:495～505.
［19］Zhou Y，Chan JH，Chan AY，et al.Transgenic plant-derived siRNAs can suppress propagation of influenza virus in mammalian cells［J］.FEBS Lett，2004，577（3）:345～350.
［20］Li YC，Kong LH，Cheng BZ，et al.Construction of influenza virus siRNA expression vectors and their inhibitory effects on multiplication of influenza virus［J］.Avian Dis，2005，49（4）:562～573.
［21］Palliser D，Chowdhury D，Wang QY，et al.An siRNA-based microbi-cide protects mice from lethal herpes simplex virus2infection［J］.Nature，2005，439（7072）:89～94.
［22］ Das AT，Brummelkamp TR，Westerhout EM，et al.Human immunodefi-ciency virus type1escapes from RNA interference-mediated inhibition［J］.J Virol，2004，78（5）:2601～2605.
［23］Zheng ZM，Tang S，Tao M.Development of Resistance to RNAi in Mam-malian Cells［J］.Ann N Y Acad Sci，2005，1058:105～118.