CCK-8法检测疟原虫HGXPRT蛋白刺激对淋巴细胞的增殖作用

    摘要:目的 检测疟原虫HGXPRT蛋白刺激淋巴细胞的增殖效果。 方法 以HGXPRT蛋白免疫小鼠后制备淋巴细胞，与相应刺激物共同培养后采用CCK-8法检测淋巴细胞的增殖情况。 结果 不同浓度的HGXPRT对淋巴细胞的刺激效果不同，以5μg/ml时刺激增殖效果最好。 结论 HGXPRT对淋巴细胞具有增殖作用。
   
　　关键词:HGXPRT蛋白;淋巴细胞增殖;CCK-8;疟原虫
   
　　Detection of lymphocyte proliferation stimulated by HGXPRT protein of Plasmodium falciparum.

　　WANG Bing，ZHANG Dong-mei，PAN Wei-qing.

　　（Department of Etiologic Biology，Second MilitaryMedical University，Shanghai200433，P.R.Chi-na）
   
　　Abstract:Objective To determine the effect of proliferation of lymphocytes stimulated by Plasmodium falciparum HGXPRT protein. Methods Lymphocytes from BALB/c mice immunized with Plasmodium falciparumHGXPRT protein were prepared and the proliferation of lymphocytes was determined by CCK-8after jointly cultured with corresponding stimulators. Results Effects of stimulation depended on the concentration of Plasmodium falciparumHGXPRT and the concentration of5μg/ml was the most effica-cious for the proliferation of lymphocytes. Conclusion Plasmodium falciparumHGXPRT can stimulate the proliferation of lym-phocytes.
   
　　Key words:HGXPRT protein;Lymphocyte proliferation;Plasmodium falciparum
      
　　疟原虫仅能通过嘌呤核苷酸补救合成途径合成生命所必需的核苷酸，在此过程中，次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine guanine xanthine phosphoribosyl transferase，HGXPRT）是该合成途径的关键酶，因此HGXPRT在疟原虫的核苷酸合成过程中起着非常重要作用。有研究表明，HGXPRT能诱导机体产生细胞免疫反应，激活疟原虫特异性的具有保护作用的CD4 + T细胞 ［1］ ，成为疟疾疫苗研发中的重要的靶抗原。本研究室用毕赤酵母重组表达了疟原虫HGXPRT蛋白并对其进行了免疫学研究，其中用CCK-8法检测了该蛋白对淋巴细胞的增殖作用并对其结果进行了分析。

　　1 材料和方法
   
　　1.1 实验动物 雌性BALB/c小鼠，6～8周龄，体重18～20g，购自中科院上海实验动物中心。
   
　　1.2 主要仪器及试剂 重组恶性疟HGXPRT蛋白由本室毕氏酵母表达纯化，完全弗氏佐剂购自美国Sigma公司，RPMI-1640干粉培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，Cell Counting Kit-8试剂购自日本同仁化学研究所，刀豆蛋白A（ConA）购自上海生物化学试剂公司，ELX800型酶标仪（BIO-TEK）。
   
　　1.3 淋巴细胞制备 将抗原与完全弗氏佐剂等体积乳化免疫小鼠，每只20μg/200μl，双前肢皮下及双后肢足垫免疫7～10d后取腋下、腹股沟及窝淋巴结，制备淋巴细胞。
   
　　1.4 细胞培养 调整细胞浓度为1×10 6 /ml于24孔板中培养，2ml/孔。加入HGXPRT作为刺激物，分四个浓度梯度，1μg/ml，5μg/ml，25μg/ml，125μg/ml。同时以刀豆蛋白A（ConA）作为阳性对照，以PBS作为阴性对照，
   
　　1.5 结果检测 细胞培养7d后重悬，调整浓度为1.5×10 5 /ml，加入96孔板，100μl/孔，6复孔，同时设立空白对照孔（不加细胞）。加入CCK-8试剂，10μl/孔，于37℃，CO 2 培养箱中培养4h，每孔加入10μl1w/v%SDS溶液（十二烷基磺酸钠）终止反应。用酶标仪在450nm处测定吸光度。
   
　　1.6 统计学分析 数据以x±s表示，组间比较采用t检验。

　　2 结果与讨论
   
　　由表1可以看出，在特异性抗原HGXPRT蛋白的刺激下，小鼠淋巴细胞出现了明显的增殖反应，四个浓度梯度组与对照组相比，均出现了明显的增殖反应（P<0.05）。其中刺激浓度为5μg/ml时，与其他三个实验组相比，细胞增殖效果最好（P<0.05），因此可以确定HGXPRT的最适刺激浓度为5μg/ml。
   
　　表1 不同处理组淋巴细胞增殖情况（略）
   
　　Table1 Lymphocyte proliferation of different group

　　※P<0.05vs control group
     
　　测定淋巴细胞增殖的方法有很多，传统上应用较多的MTT、同位素［ 3 H］标记等方法其灵敏度和准确度不高，并且［ 3 H］标记可能给环境带来放射性污染。CCK-8 试剂中含有WST-8，能被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲 月赞 染料（Formazan dye），溶解于细胞培养基中，在细胞脱氢反应中所产生的甲 月赞 物数量与活性胞的数量成正比，利用此原理可进行简便而准确的淋巴细胞增殖分析 ［2～4］ ，其灵敏度和准确度远高于MTT法 ［5］ 和 ［3H］ 胸腺嘧啶掺入分析法。

　　参考文献:
    
　　［1］Morris O.Makobongo，George Riding，Huji Xu，Chakrit Hirunpetchara，Dianne Keough，John de Jersey，Peter Willadsen，and Michael F.Good.（2003）The purine salvage enzyme hypoxanthine guanine xanthine phospho-ribosyl transferase is a major target antigen for cell-mediated immunity to malaria［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.100，2628～2633.
   
　　［2］Yoshimura K，Okabe H，Akahane H，et al.Shiga toxin1and2induce apoptosis in the amniotic cell line WISH［J］.J Soc Gynecol Investig，2002，9（1）:22～26.
   
　　［3］ Nagafuji S，Okabe H，Akahane H，et al.Trypanocidal constituents in plants4.Withanolides from the aerial part s of Physalis angulata［J］.Biol Pharm Bull，2004，27（2）:193～197.
   
　　［4］唐小龙，江振友，曾耀英，等.IL-6诱导血管内皮细胞纤溶相关蛋白的表达［J］.第二军医大学学报，2005，26（7）:783～787.
   
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