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摘要:目的 探讨已酮可可碱（pentoxifylline，PTX）对大鼠全脑缺血再灌注后炎症反应的影响及其治疗作用。 方法 采用四血管阻塞的方法，复制出大鼠全脑缺血再灌注模型。采用免疫组化法、原位杂交法和原位末端标记法分别检测假手术组（A组）、全脑缺血再灌注组（B组）、已酮可可碱治疗组（C组）海马CA1区核因子κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子-αmRNA（TNF-αmRNA）及细胞凋亡数的变化。 结果 与假手术组比较，全脑缺血再灌注组海马CA1区NF-κB和TNF-αmRNA的表达及细胞凋亡数明显增加（P<0.01）;NF-κB和TNF-αmRNA的表达分别于再灌注6h和12h达到高峰，并持续到48h;细胞凋亡数随再灌注时间的延长而逐渐增多（P<0.01）。PTX治疗后，NF-κB和TNF-αmRNA的表达下降，细胞凋亡数减少（P<0.01）。 结论 在脑复苏救治过程中，PTX可抑制NF-κB与TNF-αmRNA的表达，抑制炎症反应，减少细胞凋亡而发挥脑保护作用。
关键词:已酮可可碱;全脑缺血再灌注;核因子-κB;肿瘤坏死因子-αmRNA;凋亡
Effect of pentoxifylline on inflammatory reaction of rats with global cerebral ischemia-reperfusion.
CHEN Wei-feng，LIU De-hong.
（Emergency Department of Shenzhen Municipal Second People′s Hospital，ShenZhen518028，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To explore the protective effects of pentoxifylline（PTX）on rats with global cerebral ischemia-reperfu-sion. Methods The model of global cerebral ischemia-reperfusion was established by four-vessel occlusion method using im-munohistochemical technique，in situhybridization and in situ end labeling technique（TUNEL），the expressions of NF-κB and TNF-αmRNA and the number of the apoptotic cell were examined in the sham-operated group（group A），the control group（the group after global cerebral ischemia-reperfusion treated with Saline，group B）and the group treated with PTX（the group after global cerebral ischemia-reperfusion treated with PTX，group C）separately. Results Compared with group A，the expressions of NF-κB and TNF-αmRNA in group B increased significantly（P<0.01），with a peak at6h and12h respectively.As the time of reper-fusion was prolonged，the number of apoptotic cell gradually increased（P<0.01）.Compared with group B，the expressions of NF-κB and TNF-αmRNA and the number of apoptotic cell in group C decreased（P<0.01）. Conclusion PTX may down-regulate the expressions of NF-κB and TNF-αmRNA after global cerebral ischemia-reperfusion.It inhibited the inflammatory re-action and attenuated cellular apoptosis.
Key words:Pentoxifylline;Global cerebral ischemia-reperfusion;Nuclear factor kappaB;Tumor necrosis factor-αmRNA;Apoptosis
脑缺血再灌注损伤的机制尚未完全阐明，目前认为缺血再灌注后的炎症反应可能是其重要机制之一。NF-κB是目前发现的与炎症有关的重要转录因子之一，参与多种细胞因子和炎症介质的转录调节。TNF-α是重要的前炎症细胞因子，在脑缺血再灌注的炎症反应中起非常重要的级联放大作用。已酮可可碱（pentoxifylline，PTX）是甲基黄嘌呤衍生物，是一种非选择性磷酸二酯酶抑制剂，过去通常用来治疗症状性血管功能不全，尤其是局部微循环障碍。近年来，一些研究证实其在抑制炎症反应有潜在作用 ［1～3］ ，但其是否对细胞因子的上游调节因子—核转录因子有调节作用，目前还不清楚。因此，我们通过观察Wistar大鼠全脑缺血再灌注后NF-κB和TNF-αmRNA表达的变化及PTX对其干预的影响，探讨PTX对全脑缺 血再灌注炎症反应的影响及其保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料 ①动物:Wistar大鼠75只，雌雄不拘，体重250～300g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。②主要试剂和仪器:6%水合氯醛（武汉同济医院药剂科），已酮可可碱注射液（安徽环球药业股份有限公司），兔抗NF-κB P65亚单位多克隆抗体（美国Santa Cruze公司），链霉亲合素-生物素-酶复合物（SABC）检测试剂盒（武汉Boster公司），IL-1βmRNA原位杂交检测试剂盒（武汉Boster公司），原位检测凋亡细胞试剂盒（德国宝灵曼公司），DAB显色试剂盒（武汉Boster公司）。电热烧灼器（上海医疗器械八厂），光学显微镜（Olympus），HPIAS-1000彩色病理图像分析系统（华中科技大学同济医学院实验医学中心）。
1.2 模型制作及标本采集 采用Pulsinelli等四血管阻塞的方法建立大鼠脑复苏模型。以6%水合氯醛0.4ml/100g腹腔内注射（ip.）麻醉。假手术组（A组）动物只分离第一颈椎两侧横突孔，但不电凝双侧椎动脉，分离双侧颈总动脉但不夹闭;全脑缺血再灌注组（B组）动物电凝双侧椎动脉并分别用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉10min，而后松开动脉夹形成再灌注;PTX治疗组（C组）于再灌注时给予PTX注射液（10mg/kg）腹腔内注射，后每间隔6h予等量注射;全脑缺血再灌注组（B组）于再灌注时，给予等容量的生理盐水（5ml/kg），后每间隔6h等量注射;实验中保持大鼠体温（37±0.5）℃，未昏迷或缺血后有癫痫、抽搐等并发症大鼠均放弃。分别于再灌注2h、6h、12h、24h和48h5个时间点（每个时间点5只大鼠）迅速横断大鼠脊髓，取出脑组织，以4%多聚甲醛液固定后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，常规石蜡包埋，在脑海马CA1区连续切片，厚度6～8μm。
1.3 观察项目及检测方法 ①NF-κB活性测定:用免疫组织化学染色检测;石蜡切片经新鲜配制的3%H 2 O 2 溶液灭活内源性过氧化物酶，0.1M PBS洗;加一抗（兔抗小鼠NF-κB P65亚单位的多克隆抗体，经预定实验定为稀释度1:200），4℃置湿盒过夜，0.1M PBS洗;依次加入二抗（生物素化羊抗兔）和三抗（辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素），DAB显色。阳性细胞为光镜下细胞核内出现棕黄色物质。②TNF-αmR-NA的表达:用原位杂交法检测;石蜡切片经新鲜配制的3%H 2 O 2 溶液室温处理10min，蒸馏水洗;切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃消化10min，蒸馏水洗;每张切片上依次加入20μl的预杂交液和杂交液，置恒温箱杂交，（2～0.5）×SCC梯度处理，滴加封闭液和生物素化鼠抗地高辛，0.5M PBS洗5min×4次，再滴加SABC和生物素化过氧化物酶，0.5M PBS洗5min×4次，DAB显色。阳性细胞为光镜下胞浆中 出现棕黄色物质。③细胞凋亡:用原位末端标记法;切片常规脱蜡逐级酒精至水化;蛋白酶K（15μg/ml），37℃，30min;PBS清洗后滴加原位末端标记法反应液（TDT buffer8μl，2mol/L Bio-dUTP3μl，TDT酶0.4μl，三水28.6μl），37℃，2h;滴加SA复合物，37℃，1h;DAB显色5～20min（镜下监测，显色满意后终止反应）;苏木素复染，常规脱水、透明，中性树脂封片，镜下观察。显微镜微尺随机计数5个线性长度1mm的阳性细胞数，取平均值。
1.4 数据处理与统计学分析 光镜观察和定量分析运用HPIAS-1000彩色病理图像分析系统（同济医学院实验中心提供）对免疫组化和原位杂交的切片进行图像分析，分析过程中的所有切片的放大倍数、光源强度均相同。测定阳性细胞的平均光密度值（OD）。所得数据以（x±s）表示，SPSS11.5软件处理，多组均数的比较用方差分析。NF-κB与TNF-αmRNA及细胞凋亡数的相关性，采用Pearson相关分析。P<0.05表示差异有显著性意义。
2 结果
2.1 全脑缺血再灌注后NF-κB活性的变化 全脑缺血再灌注后海马CA1区NF-κB的活性于再灌注2h即明显升高（P<0.01），6h达到高峰，其后高峰逐渐下移，但在所观察的时间点里，与假手术组比较差异均有显著性意义（P<0.01）。在各对应时间点PTX可明显降低再灌注后的NF-κB活性（P<0.01）。见表1。
2.2 全脑缺血再灌注后TNF-αmRNA表达的变化 全脑缺血再灌后海马CA1区TNF-αmRNA的表达在再灌注2h即明显升高（P<0.01），12h达到高峰，其后高峰逐渐下移，但在所观察的时间里，与假手术组比较差异均有显著性意义（P<0.01）。在各对应时间点PTX可明显降低TNF-αmRNA的表达（P<0.01）。见表2。
表1 全脑缺血再灌注后NF-κB活性的变化（略）
注:与A组比较※P<0.01;与B组比较 # P<0.01。
表2 全脑缺血再灌后TNF-αmRNA表达的变化（略）
注:与A组比较※P<0.01;与B组比较 # P<0.01。
2.3 全脑缺血再灌注后细胞凋亡数的变化全脑缺血再灌注后细胞凋亡数随再灌注时间的延长而逐渐增多（P<0.01），在各对应时间点PTX可明显减少再灌注后的细胞凋亡数（P<0.01）。见表3。
表3 全脑缺血再灌后细胞凋亡数的变化（略）
注:与A组比较※P<0.01;与B组比较 # P<0.01， ## P<0.05。
3 讨论
炎症反应的激活是脑缺血再灌注损伤的重要机制。本研究以四血管阻塞的方法，复制出大鼠全脑缺血再灌注模型。大量研究表明，脑缺血再灌注可激活炎症反应，再灌注的炎症反应促进了继发性的脑损害，是脑再灌注损伤的主要原因之一。NF-κB作为一种普遍存在的转录因子，是多种信号转导途径的汇聚点，在调节脑缺血再灌注炎症反应的基因中起中心环节作用。脑缺血再灌注可导致NF-κB的激活在许多研究中都已得到证实。Berti R等 ［4］ 用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的方法检测脑缺血再灌注后NF-κB的活性，发现在3h、6h、12h、24h和72h5个再灌注时间点NF-κB的活性均明显增高。Liu SJ等 ［5］ 用凝胶电泳迁移分析实验（EMSA）发现脑缺血再灌注0.5h后NF-κB的活性即明显升高，6h达到高峰，24h降到1h的水平。本实验发现，NF-κB的表达在2h即明显升高，6h达到高峰，后逐渐下降，但直至48h仍明显高于假手术组，与上述研究结果相符。激活后的NF-κB可高效诱导多种细胞因子、粘附分子和趋化因子等的表达，同时对参与炎症反应放大与延续（即级联瀑布效应）的多种酶的基因表达也具有重要的调控作用 ［6］ 。TNF-α是NF-κB介导产生的一种重要的细胞因子，它可通过多种途径造成组织和细胞损害:使白细胞浸润，血小板粘附内皮细胞，激活诱导型一氧化氮合酶（iNOS）通路产生过量一氧化氮（NO）等。Lavine等 ［7］ 用多克隆兔抗鼠中和抗体研究其对脑缺血再灌注损伤的作用，结果发现，抗TNF-α抗体可使局灶性脑损伤皮质梗死面积缩小71%，皮质下梗死面积缩小58%，并增加再灌注后脑血流量，特别是缺血中心区的脑血流量，促进神经功能恢复。本实验发现，全脑缺血再灌注时NF-κB活性与TNF-αmRNA表达均明显增加，细胞凋亡数也明显增加，说明NF-κB和TNF-αmRNA参与了细胞凋亡的发生，与Hicken- bottom等 ［8］ 报道的相符。
因为NF-κB是脑缺血再灌注后炎症反应的中心环节，所以拮抗NF-κB的活化，可能起到有效的抗炎效果，从而发挥脑保护作用。Carroll JE等 ［9］ 发现N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC），一种抗氧化剂既能明显地降低NF-κB的表达，也能有效减少脑梗死的面积。本组结果表明，PTX可减少全脑缺血再灌注时NF-κB在细胞核内的表达，并可在转录水平上抑制TNF-αmRNA的表达。结果说明，PTX在脑复苏治疗过程中可能通过抑制NF-κB的活化而抑制炎症介质如TNF-α的表达，从而对全脑缺血再灌注损伤起治疗作用。至于，PTX能否通过抑制NF-κB的活性进而抑制其它重要的炎症细胞因子如白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和白介素-8（IL-8）等的表达，需进一步的实验证实。
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