1986年Sen和Baltimore首先报道核因子-kappaB（NF-κB），随后十多年中NF-κB在细胞核内外信息传递中的作用越来越受到许多领域研究者的关注。NF-κB能诱导或协同调控多种具有重要生物医学意义的基因，如编码炎性细胞因子、趋化因子、干扰素、MHC蛋白、生长因子、细胞粘附因子的基因和病毒基因等。它参与机体炎症反应 ［1］ 、血管再生、凋亡等生理和病理生理过程 ［2］ 。NF-κB首先在淋巴细胞中被作为免疫球蛋白kappa轻链基因表达的调节因子而发现，后来在其他许多细胞中也发现可有NF-κB表达 ［3］ 。作为一个核心调节因子，它参与了心脏病、肝脏病、肾脏病，甚至五官科等疾病的发生。基于它在体内分布广泛，且具有多样化的生物学作用，在基础与
临床研究中日益受到重视。但NF-κB的研究方法，并不是广为人知，在此作一介绍。
1 细胞中NF-κB的测定
1.1 凝胶电泳迁移率转变分析（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA） ［4］ EMSA特异性强，是一种简单、快速和极为灵敏的用于检测样品中DNA序列特异性蛋白质的方法。NF-κB活化入核后，可以与靶基因启动子上游特异的κB序列结合。将同位素标记的NF-κB特异的DNA序列，与核粗提物相互作用后进行电泳，那么与DNA特异结合的NF-κB因为具有较大的分子量而使迁移速度明显减慢，因而产生了与游离DNA位置不同的对应于NF-κB/DNA复合物的清晰电泳条带，根据同位素的信号强弱可以直接反映NF-κB/DNA复合物形成的多少。
1.1.1 抽提核蛋白 ［5］ 药物作用细胞1h后收集细胞，预冷的PBS漂洗2次，以BufferA（10mM Hepes，pH7.9，10mM KCl，0.1mM EDTA，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5mM PMSF）重悬，10min后加入l0%NP40至终浓度0.6%，混匀后l2000rpm4℃离心20s，弃上清，以Buffer B（20mM Hepes，pH7.9，0.4M NaCl，1mM EDTA，1mM EDTA，0.1mM PMSF）重悬，4℃孵育20min，1200Orpm4℃离心20s，取上清即为核蛋白，-70℃冻存或即刻使用。
1.1.2 结合反应 取2μg核蛋白抽提物，与2μl5×binding buffer、20～50fmol（30000～50000cpm）的γ- 32 P-ATP标记的NF-κB特异寡核甘酸探针混匀 ［6］ ，以去离子水补足总体积10μl，室温孵育10min。
1.1.3 电泳 参照试剂盒说明灌制PAGE凝胶，待凝胶聚合后，于0.5×TBE缓冲液中电泳。
1.1.4
曝光 将凝胶转移至滤纸，保鲜膜包裹，干胶仪抽干，置于磷屏曝光过夜后于FUJI FILM FLA5000凝胶成像系统拍照分析。
2 组织中NF-κB的测定 2.1 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） ［1］
2.1.1 组织总RNA的提取 （1） 称取l00mg组织，剪碎后加500μl GIT变性液，在匀浆器内匀浆，依次加入2M醋酸纳50μ1，水饱和酚500μl，氯仿100μl，每步均需混匀，旋涡震荡器混匀10s，冰浴5～15min。（2）4℃10000g离心10min后，小心吸取上清移入1.5ml Eppendorf管中，切忌吸入蛋白，加入等体积的异丙醇，-20℃放2h。（3）4℃12000g离心20min后，弃上清;沉淀用100μl GIT变性液重溶，加入等体积异丙醇混匀。-20℃放置1h。（4）4℃12000g离心20min后，弃上清，用75%乙醇洗1遍，至此可加入1ml无水乙醇于-70℃保存备用。（5）干燥后DEPC水溶解RNA沉淀，取1μl在紫外分光光度计测出A260及A280的值，计算所提总RNA的含量。
2.1.2 逆转录（RT）反应 于DEPC处理0.5ml Eppendorf管中，按加入如下所示试剂（总RNA10μg、M-MLV1μl、5×RT buffer4μl、0.1M DTT2μl、4×d NTP1μl、下游引物P11μl、去Rnase水补至20μl）快速离心混匀;37℃1h，95℃10min灭活M-MLV逆转录酶，快速离心使蒸汽沉于管底。
2.1.3 PCR反应 在上述20μl RT产物的0.5ml Eppendorf管中，继续加入如下所示试剂（10×PCR buffer10μl、15mM MgCl 2 8μl、4×dNTP1μl、上游引物P21μl、超纯水58μl）快速离心混匀。95℃变性5min，离心使蒸汽沉于管底，加入2μl（IU/μ1）TaqDNA聚合物，快速离心混匀，加入100μl液体石蜡。
循环条件:94℃变性，1min;56℃退火，1min;72℃延长，1.5min。共循环32次，末次72℃延伸10min，取PCR产物10μl经1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，在紫外灯下观察电泳结果并拍照。
2.1.4 定量分析 将PCR产物电泳凝胶图像扫入计算机，利用数字凝胶成像分析系统对电泳条带进行光密度定量，并根据各条带与
GAPDH光密度的比值进行定量统计分析。 相对系数公式:相对系数=NF-κB的表达强度/GAPDH的表达强度。
2.2 免疫印记法（Western-Blot） ［7，8］
2.2.1 组织匀浆制备 称取100mg组织，冰上剪碎后，加入1ml匀浆缓冲液A（1×PBS，含0.5%去氧胆酸钠、0.1%的SDS，用时加100μmol/L的PMSF，30μmol/L的抑肽酶）匀浆，冰上孵育30min，再4℃20000g离心30min，沉淀以缓冲液B（缓冲液A加1%NP-40）悬浮，4℃震荡混匀，再4℃20000g离心20min，取上清，用Bradford法测定蛋白含量，-80℃冰箱保存。
2.2.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 ［1］ 采用Laemmli UK等法进行SDS-PAGE电泳:备玻璃板，安装电泳槽。灌注12%的分离胶，在分离胶上面加入约3m1的覆盖物（0.1%的SDS）。凝胶聚合完成后，倒掉SDS，用去离子水冲洗凝胶上部数次，吸水纸吸净残存的液体。配制5%的成层胶。将成层胶注入分离胶上部，插入梳子。在成层胶聚合的同时，将样品与样品缓冲液混合，100℃加热5min。在成层胶聚合完成后，将电泳缓冲液倒入电泳槽后，拔掉梳子。将蛋白质分子量标准与组织匀浆液（50μl）按次序上样。电泳:开始时电压为100V/cm，染料进入分离胶后，将电压增至200V/cm，直至染料到达分离胶底部，断开电源。
2.2.3 蛋白质的电转移 转膜液4℃预冷，剪一角作标记，将待转移胶浸在转移缓冲液中漂洗一下，剪与凝胶大小一样的whatman3MM滤纸和醋酸纤维膜（Hybond ECL），将膜用蒸馏水漂洗一下。将上述滤纸和膜用电泳转移液浸泡10min。将转印夹层安装在半干转移仪中，加生物水，灰面对槽里面，30mA恒流转移1h。转移结束后，依次去掉滤纸、SDS-凝胶，在醋酸纤维膜上作好标记。
2.2.4 封闭 用PBS缓冲液洗膜5min，将膜浸于封闭液中，摇床摇60min。
2.2.5 靶蛋白与第一抗体反应 第一抗体溶液的配制:用抗体稀释液稀释NF-κB抗体（l:200），封闭结束后，用PBS洗膜2次，将膜放入盛有一抗的溶液的塑料袋中封口，室温2h，取出膜于TBST溶液中漂洗，10min×3次。
2.2.6 靶蛋白与第二抗体反应 将膜放入盛有辣根过氧化物酶标记的二抗溶液的塑料袋中封口，室温摇床1h，取出膜于TBST溶液中漂洗，10min×2次，TBS溶液洗10min×2次。
2.2.7 显色 将ECL Western blot system试剂盒中溶液Ⅰ和溶液Ⅱ等体积混合。将膜取出，甩去多余的液体，将含有蛋白质的膜面向上，放在保鲜膜上，加上述显色液，室温温育1min。在暗房中，将膜正面朝下放在感光胶片上，曝光15min。依次放入显影液、定影液中显影定影。
2.3 免疫组织化学法（LSAB法） ［9，10］ 其它方法如EMSA不能区分NF-κB的活性是来自何种细胞。而免疫组织化学方法可通过直观的定位明确NF-κB表达的细胞学来源。
2.3.1 组化反应前的准备 在烤片机上对切片烘烤。然后依次用二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3各15min进行脱腊。最后复水:依次为100%酒精1、100%酒精2、100%酒精3、95%酒精、80%酒精、70%酒精、50%酒精、ddH20各10min。
2.3.2 组化反应 根据预实验结果选择合适抗体浓度（注:将切片放置切片染色缸漂洗所用的漂洗液均为PBS液，其浓度为0.01M，pH7.2）。（1）去除内源性过氧化物酶:漂洗5min×3次，0.3%双氧水-甲醛10min。（2）封闭:漂洗5min×3次，3%牛血清白蛋白封闭液加于切片上，放置湿盒中37℃，30min。然后吸纸吸去封闭液。（3）一抗孵育:抗体用PBS（0.1M pH7.2）做适当稀释，放置湿盒中4℃冰箱过夜。（4）二抗孵育:漂洗5min×3次，生物素化的二抗（0.5Mtris-HCL pH7.6适当稀释）加于切片，室温下湿盒中放置20min。（5）加链菌·亲和素液:漂洗5min×3次，链菌·亲和素液（0.5Mtris-HCl pH7.6适当稀释）加于切片，室温下湿盒中放置20min。（6）DAB显色:漂洗5min×3次，DAB与稀释液1:50配制，一边显色，一边在光镜下观察，适时PBS冲洗终止反应。（7）复染、脱水:苏木素衬染细胞核数秒，然后清水冲洗。脱水、二甲苯透明。
3 小结
综上所述，NF-κB是一种重要的转录因子复合物，在包括心脏病在内的多种疾病的病理过程中起关键作用。而对NF-κB的最新研究方法主要为以上4种，其特点及研究角度不同。如下:（1）EMSA主要用于细胞中NF-κB的检测;RT-PCR、Western-blot和免疫组化主要用于组织中NF-κB的检测。（2）免疫组化主要用于直观显示;EMSA、RT-PCR、Western-blot主要用于定性测定。（3）RT-PCR主要用于NF-κB的mRNA的检测;Western-blot主要用于NF-κB的蛋白质的检测。（4）免疫组化特异性最好，可用于细胞定位;EMSA最常用。利用上述NF-κB的基本实验方法，进一步探索NF-κB在细胞因子和其它促炎症分子生成中的作用，寻找和研究阻断NF-κB激活的有效制剂，可阐明疾病的发病机制，为治疗开辟新的途径。
参考文献
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作者单位:250031山东大学医学院
山东大学齐鲁医院心内科
山东大学心血管病研究中心
作者：
李安安 卜培莉 刘春喜 2005-8-3