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Genetic analysis of30severe spermacrasia and azoospermia patients.
CHEN Xue-yin，LI Qi，MA Yan-lin，et al.
（Affiliated Hospital of Hainan Medical College，Haikou570102，Hainan，P.R.China）
摘要:目的 探讨严重少精症和无精子症与遗传因素的关系。 方法 260例染色体G带分析;116例Y染色体AZF区18个微缺失位点进行多重PCR基因扩增检测分析。 结果 30例严重少精症和无精子症患者发现遗传异常，其中26例染色体异常，4例AZF基因有微缺失。 结论 严重少精症和无精子症与遗传密切相关，但严重少精症和无精子症的染色体分析与Y染色体AZF微缺失位点检测无相关性。
关键词:严重少精症;无精子症;无精子因子;Y染色体微缺失;染色体核型分析
近年来研究表明，男性原发无精症（Idiopathic azoospermia，IA）和少精症（Idiopathic oligospermia，IO）与遗传因素，包括染色体数目、结构异常外，部分与Y染色体微缺失（Azoospermia factor AZF）密切相关。现将海南医学院附属医院妇产科生殖医学中心门诊30例原发不孕患者，精液连续检查确诊无精症和少精症的遗传病因结果分析报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料来源 30例均来自海南医学院附属医院妇产科生殖医学中心门诊，婚后原发不孕就诊病人。年龄20～45岁，平均年龄32.9岁。其中无精症9例，严重少精症21例。按WHO精液常规分析标准确定为无精或严重少精。精液检查至少分析2次以上（包括离心沉淀厚片分析）。
1.2 检测方法
1.2.1 细胞遗传学检查 常规外周血淋巴细胞培养，染色体G带分析，镜下计数30～100个中期分裂相，分析3个以上核型。
1.2.2 分子遗传学检查 外周血常规酚/氯仿提取DNA，检测DNA浓度和纯度。引物由上海生工生物技术公司合成。经多重PCR技术对Y染色体微缺失AZFa区sY84、sY86、sY182;AZFb区sY121、sY124、sY127、sY128、sY130、sY134;AZFd区sY145、sY152、sY153;AZFc区sY239、sY242、sY254、sY255、sY157共18个微缺失位点进行扩增。采用100bp的分子量标准，产物经聚丙烯酰氨凝胶垂直电泳或琼脂糖电泳后，用Alphalmager2200凝胶成像系统观察分析条带。
2 结果
2.1 染色体核型分析 260例严重少精或无精子症患者检出染色体异常26例，占10%（26/260）。见表1。
2.2 AZF基因检测 116例严重少精或无精症者，基因微缺失共4例，占3.4%（4/116）。其中AZFa+AZFd+AZFc缺失1例，AZFd+AZFc缺失3例。见表2。
表1 染色体异常者的核型异常（略）
表2 Y染色体AZF微缺失位点患者（略）
3 讨论
遗传性因素是引起男性不育的主要因素，其中染色体异常与无精症和严重少精症的发生密切相关。精子的发生受诸多有序表达的基因控制，染色体结构数目的畸变可影响这些基因的功能，进而影响精子的发生。导致无精症（IA）的最常见核型为47，XXY，本文有1例47，XXY/46，XY，在IA组病人中，占10%（1/9），与文献报道相一致。47，XXY出现无精现象，是由于X染色体上参与性别决定的基因剂量增加，影响性别决定“调控串模式”的协调表达而造成的。本文有3例45，XY，rob（13，14）易位，1例46XY，t（9，15）易位。据文献报道罗氏易位在少精、无精子症患者中发生率高于正常人群 ［1］ ，它可干扰精母细胞粗线期X正常失活，导致后续生精过程障碍。一些研究常染色体上也有许多影响精子生成的基因 ［2］ ，当易位造成基因断裂或缺失时可导致少精、无精子症。本文有5例46，XY，inv（9）倒位，可能是由于染色体倒位产生不平衡配子引起无精和严重少精。但inv（9）在正常人群中的发生率约为1%。本文中46，XY，inv（9），在染色体异常组中占19%，是否引起无精和严重少精，还需进一步研究。值得一提的是本文严重少精子症、无精子症中有15例大Y（大于等于18号染色体），在染色体异常组中，占57.6%（15/26），明显高于文献报道，是否向有些学者认为系多态现象，属正常变异，无临床意义，尚无确切定论。我们认同性染色体关系到性的分化，Y染色体存在，未分化的性腺则发育成睾丸，但当Y染色体结构异常，可不同程度产生一定的临床效应。导致睾丸发育不全或性发育畸形，致精子生成障碍，使精子生成减少或缺失，产生无精或严重少精。还需进一步深入研究。染色体异常不仅影响精子的生成，另一方面即使通过辅助生殖助孕，也容易形成具有不平衡染色体的配子，导致妊娠失败，可见少精、无精子症患者行染色体检查是必须的，不可忽视。
1976年，Tiepolo和Zuifaidi首先提出Y染色体上有多个基因参与生精过程 ［3］ 。近20多年来研究，发现男性特有的Y染色体上面存在一个关键的与生育相关的因子的区域，称为AZF区。目前认为在AZF区上存在四个精子发生亚区（AZFa、AZFb、AZFc、AZFd），各亚区包含的位点在男性生殖细胞发育的不同时期起着不同的作用，位点的缺失可致患者表现为少、弱精症或无精症从而引发不育。无精症和少精症AZF总的缺失率不同实验室报道差别很大1%～55% ［4］ 。我实验室偏低，占3.4%（4/116），可能是研究对象选择标准不同。一般认为，Y染色体的近端缺失（涉及AZFa和AZFb），表现以唯支持细胞综合症为主的严重生精障碍，Y染色体的远端缺失（涉及AZFd和AZFc），可残留岛状的生精正常区域 ［5］ 。本实验室对无精症患者中，对检查睾丸过小或睾丸活检仍无精子患者，一般不再行AZF基因检测。本文116例严重少精症和无精子症患者中，仅有1例合并AZFa+AZFd+AZFc缺失，3例AZFd+AZFc缺失。其中4例Y染色体微缺失均有AZFd+AZFc缺失，证明AZFc缺失表现为严重少精症和无精子症，同文献报道一致 ［6］ 。本文4例Y染色体微缺失患者，无一例出现染色体异常。反之，26例染色体核型异常者，无一例出现AZF基因缺失。目前还需临床大量资料进一步深入研究。总之，开展染色体和AZF检测，可全面评价男性不育遗传缺陷，从而更好的解释发病原因，提供遗传咨询和指导临床诊疗。
参考文献:
［1］Baccetti B，Capititani S，Collodel G，et al.Infertile spermatozoa in a human carrier of robersonian translocation14;22［J］.Fertil Steri，2002，78（5）:1127～1130.
［2］ Quintana de la Rosa JL，Gallegos Avila G，Garcia Cavazos R，et al.Chromosomal translocation3;22in an infertile man［J］.Fertil Sertil，2001，75（6）:1222～1223.
［3］Tiepolo L，Zuffardi O.Localization of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm［J］.Hum Genet，1976，34（2）∶119～124.
［4］Dada R，Gupta NP，Kucheria K.Yq microdeletions-azoospermia factor can-didate genes and spermatogenic arrest［J］.J Biomol Tech，2004，15（3）:176～183.
［5］Maurer B，Simoni M.Y chromosome microdeletion screening in infertile men［J］.J Endocrinol Invest，2000，23（10）:664～670.
［6］Mc Elreavey K，Krausz C，Patrat C，et al.Male infertility and microdeletions of the Y chromosome［J］.Gynecol Obstet Fertl，2002，30（5）:405～412.