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摘要:目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65和汉坦病毒G2重组融合基因为基础的核酸疫苗。 方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中，扩增出HSP65的编码基因，从T-H8205G2质粒扩增出G2蛋白的编码基因，经相应限制性核酸内切酶消化后，插入真核表达载体pcDNA3.1/His，并将此重组质粒通过酶切、SDS-PAGE分别测定表达产物的相对分子量。 结果 获得正向插入的pcDNA3.1/His-HSP65-G2重组表达质粒，与理论预期大小一致。 结论 以编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功，为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定了基础。
关键词:核酸疫苗;结核分枝杆菌;热休克蛋白65;汉坦病毒;G2蛋白
Construction and recombinant of hsp65gene of Mycobacterium tuberculosis and G2gene of Hantavirus H8205.
HUANG Hao，HUANG Han-ju，GUAN Jiang-feng，et al.
（Central Laboratory Department of Wuhan Municipal First Hospital，Wuhan430022;Department of Pathogenic Biology，Tongji Medical College Elementary School of Huazhong Science and Technology Un-versity，Wuhan430031，Hubei，P.R.China）
Abstract:Objective To construct nucleotide vaccine based on the recombinant plasmids of hsp65gene of mycobacterium tu-berculosis H37Rv strain and G2gene fragments of Hantavirus H8205strain. Methods The gene encoding heat shock protein65kd and G2glycoprotein were amplified from genome of Mycobacterium tuberculosis and T-H8205G2plasmid by routine polymerase chain reaction（PCR）.After corresponding to restriction endonuclease digestion，the fragment were inserted into downstream of the vector pCDNA3.1/His to obtain the recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1/His-hsp65-G2.The recombinant plas-mid pcDNA3.1/His-hsp65-G2were used to analyze the molecular weight respectively. Results The positive recombinant plas-mid harbouring the right inserted G2glycoprotein gene and hsp65gene fragment was obtained. Conclusion The successful con-struction of recombinant eukaryotic expression vector based on hsp65gene of mycobacterium tuberculosis and G2gene fragments of Hantavirus H8205strain，lays the foundation for further researching in prevention and treatment of tuberculosis and HFRS.
Key words:Nucleotide vaccine;Mycobacterium tuberculosis;Hsp65;Hantavirus;G2glycoprotein
由汉坦病毒引起的肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒肺综合征（HPS）在我国疫区不断扩大，疫情演变呈逐年增高的趋势。同时，近年来由于结核杆菌多重耐药菌株及HIV感染者增多，唯一疫苗卡介苗，其免疫保护效果又不甚理想，根据汉坦病毒包膜糖蛋白具有多种抗原决定簇，和人结核杆菌hsp65具有分枝杆菌抗原特性，又可作为免疫佐剂在体内可明显增强T淋巴细胞的杀伤活性和调节抗原特异性的体液和细胞免疫 ［1］ 。现以编码汉坦病毒胞膜糖蛋白G 2 与人结核杆菌hsp65基因片段重组，构建正确的真核表达质粒，导入哺乳动物细胞中研究其瞬时表达，为汉坦病毒与人结核杆菌的DNA多加疫苗的发展提供了理论基础，以期用于结核病与出血热防治。
1 材料与方法
1.1 材料 结核杆菌H37Rv标准毒力株由武汉市结核病防治所赠送，TaqDNA聚合酶（Promega公司）、dNTP、小牛肠碱性磷酸酶、EcoR、T4DNA连接酶、DNAMarkerDL2000（大连宝生物工程公司）、KpnⅠ、NotⅠ、EcoRⅠ，EcoRv、DNA Marker DL2000、λ-HindⅢDNAMarker、高分子量蛋白质Marker（华美生物工程公司）、其余试剂均为国产或进口分装。质粒pcDNA3.1/His，T-H8205G2质粒、大肠杆菌DH5α由华中科技大学同济医学院病原生物系黄汉菊教授赠送。
1.2 方法
1.2.1 结核杆菌基因组DNA的提取 见文献 ［2］ 。
1.2.2 HSP65基因和G2扩增 根据结核杆菌H37Rv株HSP65基因的全序列设计上游引物p1:5′CGCGGTACCAAGCTTATGGC-CAAGACAATTGCGT3′，包含KpnⅠ，HindⅢ切点，下游引物5′CCGGGGAATTCGATATCTCAGAAATCCATGCCACCCATG3′包含EcoRⅠ，EcoRv切点，以结核杆菌基因组DNA为模板，扩增hsp65基因片段，根据H8205株G2基因的全序列设计上游引物5′GGGTTGGATATCGGGCTGCAAGTGCTTCTGAAAC3′，包含EcoRv切点，下游引物5′GGTAATGCGGCCGCTAGGACTATGC-CTTCTTGTGC，包含NotⅠ切点，提取纯化T-H8205G2质粒，以此为模板，扩增G2基因片段。
1.2.3 HSP65与G2融合基因的真核表达载体构建 将真核表达载体pcDNA3.1/His和扩增的hsp65基因片段经EcoRⅠ，KpnⅠ双酶切后，分别琼脂糖凝胶电泳纯化回收，将回收基因片段与线性连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经菌落PCR及小量提取质粒进行酶切鉴定。构建的重组融合表达质粒pcDNA3.1/His-hsp65。将纯化的质粒pcDNA3.1/His-hsp65和扩增的G2基因片段NotⅠ，EcoRv双酶切后，同上述步骤及酶切鉴定，构建的重组融合表达质粒pcDNA3.1/His-hsp65-G2，见图1。
1.2.4 质粒的制备、纯化及定量 见文献 ［3］ 。
1.2.5 NIH3T3细胞培养和传代 24孔板培养板放置玻片，按常规方法培养、传代。正常3T3细胞为梭形贴壁生长细胞。
1.2.6 质粒转染 将长满单层的NIH3T3细胞用0.25%的胰蛋白酶消化传代后继续培养，使细胞达到60%～80%铺满，将重组质粒与Lipofectin按1:4的比例用无血清的DMEM培养基混匀后，转染细胞，置37℃，5%CO 2 培养箱培养8h。弃去转染液，换含10%小牛血清的DMEM培养基继续培养24～48h，进行表达产物的SDS-PAGE鉴定。
图1 HSP65与G2融合基因的真核表达载体构建过程（略）
Fig1 Construction and Identification of Recombinent of HSP65gene of mycobacterium tuberculosis and G2gene of Hatavirus
2 结果
2.1 hsp65与G2基因PCR扩增与鉴定 以结核分枝杆菌基因组DNA和T-H8205G2质粒为模板，PCR反应扩增目的hsp65与G2基因DNA片段、电泳，分别在1.5kb、1.6kb处显示的电泳条带，与预期相符。见图2～3。
图2 HSP65基因的PCR扩增（略）
Fig2 PCR amplification of hsp65gene
Lane M:DNA marker DL2000;Lane1:PCR amplification of hsp65gene
图3 G2基因的PCR扩增（略）
Fig3 PCR amplification of G2gene
Lane M:DNA marker DL2000;Lane1:PCR amplification of G2gene
2.2 重组pcDNA3.1/His-hsp65-G2的鉴定 用KpnⅠ/EcoRⅠ进行酶切见1.62kb和6.98kb两个片段，与预期相符，说明已得到正确克隆的含hsp65-G2基因的重组体pcD-NA3.1/His-hsp65-G2，如图4。
图4 pcDNA3.1/His-hsp65-G2酶切图（略）
Fig4 pcDNA3.1/His-hsp65-G2of endonuclease digestion
Lane M1、M2:DNA markerr;Lane:fragment of pcDNA3.1/His-hsp65-G2
2.3 重组体pcDNA3.1/His-hsp65-G2在3T3细胞中表达 在转染48h的NIH3T3细胞裂解物中在分子量97～116kD处有一条蛋白条带，其相对分子量为105kD（融合表达重组体hsp65-G2应表达105kD的蛋白），与预期大小一致，该融合蛋白主要在细胞裂解物的上清中表达，如图5。
3 讨论
基因疫苗的兴起和发展为肿瘤治疗与抗病毒感染提供了新的途径，结核杆菌HSP65具有免疫优势抗原的特性，可诱导和增强机体体液免疫和细胞免疫应答的发生;同时，结核杆菌HSP65还具有载体分子（Carrier molecule）效应和免疫佐剂作用，有报道认为用分枝杆菌HSPs接种动物可使其获得抗结核分枝杆菌和麻疯分枝杆菌感染的作用.因此，现认为结核杆菌HSP65基因是构建结核DNA疫苗的有效目的基因之一 ［4］ 。由于目前在构建含有汉坦病毒cDNAs的真核表达质粒直接免疫动物的研究已有一些很有意义的工作。Hooper JW等 ［5］构建了引起肾综合症出血热的SEO型病毒基因组的M片段或S片段的真核表达载体，并将两种裸DNA分别通过基因枪法和针法两种方法注射到BALB/L小鼠的后腿肌肉，结果这两种方式免疫在动物体内都能检测到阳性抗体的产生。
图5 在3T3细胞中重组体表达的蛋白的SDS-PAGE （略）
Fig5 SDS-PAGE of the recombinant plasmids of protein
M:高分子量蛋白质Marker;1:正常细胞培养上清;2:正常细胞沉淀裂解物上清;3:转染了重组体的细胞沉淀裂解物上清（24h）;4:转染了重组体的细胞沉淀裂解物上清（48h）;5:转染了重组体的细胞沉淀裂解物上清（72h）
我们在这些研究基础上以结核分枝杆菌基因组DNA为模板进行PCR反应，扩增得到的1.6kbp片段包含HSP65的完整基因。将回收的PCR产物与汉坦病毒G2的编码基因经相应限制性核酸内切酶消化后，插入真核表达载体pcDNA3.1/His，构建pcDNA3.1/His-HSP65-G2重组表达质粒，并将此重组质粒通过脂质体介导转染3T3细胞，对筛选出的阳性克隆经鉴定，证实真核表达质粒构建成功。需进一步是对重组质粒DNA免疫后产生的免疫反应进行检测，观察在DNA免疫后保护细胞及动物免受汉坦病毒和结核分枝杆菌攻击中的作用。为汉坦病毒和结核分枝杆菌新型的多价疫苗的研制提供依据。
参考文献:
［1］Devallois，A.，K.S.Goh，and N.Rastogi.Rapid identification of my-cobacteria to species level by PCR-restriction fragment length polymor-phism analysis of the hsp65gene and proposition of an algorithm to differen-tiate34mycobacterial species［J］.1997，J.Clin.Microbiol，35:2969.
［2］居巍，刘君炎，叶林柏.结核分枝杆菌pcHSP65真核表达载体的构建及序列测定［J］.武汉大学学报（医学版），2002，23（1）:5.
［3］Sambrook J，Maniatis T et al.Molecular Cloning:ALaboratoryMannal2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，24～34.
［4］Sad，S.，R.Marcotte，and T.R.Mosmann.Cytokine-induced differen-tiation of precursor mouse CD8+T cells into cytotoxic CD8+T cells se-creting Th1or Th2cytokines［J］.Immunity，1995，2:271.
［5］Hooper JW，Kamrud KI，Elgh F，Custer Schmaljohn CS.DNA vaccination with hantavirus M segment elicits neutralizing antibodies and protects against seoul virus infection［J］.Virology，1999，255:269.