点击显示 收起
【摘要】 目的 通过探讨TNFα对激活NF-κB活性的影响，解析银杏叶提取物（GbE）在治疗哮喘中的分子机理。 方法 以Hela细胞和HL-60细胞作为工具细胞，分别经TNFα、GbE刺激，用免疫印迹方法检测IκBα的活化状况；转染带有报告基因的质粒pNF-κB-Luc，通过荧光素酶的表达情况检测NF-κB活性变化。 结果 以GbE预处理Hela细胞和HL-60细胞可以明显抑制TNFα诱导的NF-κB转录激活的活性。但用GbE预处理细胞并不能拮抗TNFα诱导的IκBα的磷酸化和降解，将GbE处理细胞时间延长和加大GbE的浓度同样不能阻止IκBα的磷酸化和降解。 结论 GbE抑制NF-κB激活的基因转录并不是通过干扰经典的IKK/NIK/IκBα活化途径，而是通过干扰其它途径或采用其它方式来实现。
【关键词】 银杏叶提取物 哮喘 核因子-κB 肿瘤坏死因子-α
Study on molecular mechanisms of GbE in treatment of asthma.
LEI Xiu-xia, YI Yan-mei, XU Bang-lao, et al.
(Laboratory Department, The Guangzhou Municipal First People’s Hospital, Guangzhou 510180, Guangdong; Center of Microbiology, Biochemistry and Pharmacology, School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-Sen university, Guangzhou 510080, Guangdong, P. R. China)
Abstract：Objective To observe the effect of extract of Ginko biloba (GbE) on the activity of nuclear factor-B (NF-B) induced by tumor necrosis factor (TNF) in asthma patients. Methods The activity of IκBα in Hela cells and HL-60 cells stimulated with TNFα or TNF combination with GbE was measured by western blotting. Two cells were transfected with a luciferase reporter gene that contains putative binding sites for NF-B, then confirmed the NF-B activation by measuring the activity of luciferase. Results By luciferase assay and western blotting,the activity of NF-B ould be suppressed in Hela and HL-60 cells pre-treated with GbE.However, extending the acting time or increase the concentration of GbE the phosphorylation and subsequent degradation of IκBα induced by TNF were not affected. Conclusion GbE sup presses the activity of NF-κB through an IKK/NIK/IκBα independent pathway in Hela cells and HL-60 cells.
Key words：Extract of Ginkgo biloba (GbE); Asthma; NF-κB; Tumor necrosis factor
支气管哮喘为常见病和多发病，其病因复杂，发病机理尚不十分清楚。目前研究证实NF-κB在哮喘发病过程中起着重要作用，其证据如下：①已经在哮喘患者的气道中发现活化的NF-κB；②诸如抗原，病毒感染,氧化剂等与哮喘病情恶化相关的因素均可激活NF-κB［1］；③治疗哮喘最有效的药物糖皮质激素同时也是NF-κB最强有力的阻遏剂之一［2］。因此抑制NF-κB的活性被认为是治疗哮喘的突破口。
哮喘的发作与许多细胞因子有关，其中肿瘤坏死因子α（TNFα）是一种可有多种细胞产生的具有广泛生物学活性的前炎症细胞因子，是哮喘发病过程中的重要因素［3］。它与受体结合可以激活多重信号转导途径，尤其是通过活化转录因子NF-κB，诱导相关基因转录，引起一系列生物学效应。而活化的NF-κB又可激活TNFα及其他细胞因子的转录，形成一个正向调控，加重哮喘病情的发作。因此抑制TNFα引起的NF-κB激活可以缓解哮喘发作。
银杏为古代裸子植物，为银杏科银杏属多年生落叶乔木，我国药典中记载银杏有润肺、平喘、止痛，用于肺虚咳嗽、冠心病和心绞痛等。研究证实，银杏叶提取物（Ginkgo biloba leaf extract，GbE）具有广泛的药理作用：拮抗血小板活化因子（PAF）、清除自由基、抗炎及抗过敏等［4］。近年来，人们发现GbE可以缓解哮喘的发作，但其机制尚不清楚。本研究拟通过探讨GbE对NF-κB通路的作用，解析GbE在哮喘治疗中的作用机理。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂 重组改构的人肿瘤坏死因子（上海赛达生物有限公司）；舒血宁注射液（万荣三九药业有限公司）；IκBα一抗（Cell Signaling公司）；羊抗兔二抗，DAB显色剂（武汉博士德生物工程有限公司）；荧光素酶检测试剂盒（Promega公司）；质粒pNFκB-Luc（Clontech公司）； 基因转染试剂（广州锐博生物科技有限公司）。
1.2 细胞培养 分别用DMEM和RPMI－1640培养基（含有10％灭活胎牛血清）重悬Hela细胞或HL-60细胞，接种于60mm培养皿或者75cm2培养瓶中，置37℃, 5% CO2培养箱中培养，待细胞密度适中时，单独加入TNFα，或者加入GbE 10～27h预处理后再加TNFα刺激。分为对照组，TNFα单独处理组，TNFα联合GbE预处理组。
1.3 免疫印迹 TNFα单独处理组，Hela细胞培养过夜，加TNFα 104～4×104单位，经5、15、30和50min孵育后收集细胞；Hela细胞加GbE预处理组，GbE预处理10～27h后加TNFα刺激，于5min或30min后收集细胞，提取总蛋白。HL-60细胞做同样处理提取总蛋白。所收集的细胞经加入含有蛋白酶抑制剂（100μg/ml PMSF，10μg/ml Aprotinin，10rg/ml Leupeptin，2.0μg/ml Pepsatin）的细胞裂解液（10μg/ml PBS，1%NP-40，1mmol/L EDTA，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS）裂解，4℃，12 500rpm离心30min，将上清移至新的EP管，蛋白检测试剂盒定量。按测定的蛋白浓度，取20～25μg待测样品与5x上样缓冲液（100mmol/L Tris-Cl pH6.8，4% SDS，20%甘油，0.2%溴酚兰，200mmol/L DTT）按比例混合，100℃加热5min变性。在10%胶上进行SDS-PAGE电泳。电泳完毕进行湿式电转于PVDF膜，室温封闭1.5h，一抗以1：2000比例孵育4℃过夜，PBST洗膜10min,羊抗兔二抗1：5000室温孵育2h，洗膜同上，ECL发光液曝光。
1.4 荧光素酶分析 为检测NF-κB被激活的情况，我们使用双荧光素酶活性分析系统，内参照PEF-RL统一转染结果。质粒pNF-κB-Luc及其阴性对照质粒pTALluc，连同内参质粒PEF-RL分别共转染Hela细胞和HL-60细胞，经翻译后表达的荧光素酶活性可直接反映NF-κB被激活的程度，具体方法：待细胞密度达到70%～80%时，进行共转染，转染后10～12h以1：50的比例加GbE，10～12h后再加TNFα刺激，8h后收集样品，按照Promega公司提供的报告检测系统标准操作方案检测细胞裂解物中荧光素酶的活性。
1.5 统计学分析 实验数据之间经过方差分析及q检验，P＜0.05，具有统计学意义。
2 结果
2.1 TNFα可激活Hela细胞、HL-60细胞中NF-κB/IκBα通路 Hela细胞加入TNFα后，5min IκBα磷酸化达到高峰，30min降解达到高峰，随后又渐渐恢复到原来浓度，50min可以见到明显的回升（图1）。TNFα对HL-60细胞的刺激类似于Hela细胞，只是与Hela细胞相比，较小剂量的TNFα就可使HL-60细胞细胞出现相同的生物效应，可能HL-60细胞对于TNFα的刺激较Hela细胞更加敏感。
图1 免疫印迹检测TNFα刺激Hela细胞后IκBα活性变化（略）
Fig 1 Western Blotting analysis for the change of IκBα activation induced by TNFα in Hela cells
2.2 银杏叶提取物对TNFα所激活的NF-κB活性的影响
2.2.1 免疫印迹结果分析 Hela细胞长至对数期时，加入不同剂量的GbE预处理。由于其短时间处理（2h）不能改变TNFα诱导的IκBα磷酸化，我们将其时间延长至10～26h。处理不同时间段后，加TNFα刺激5min或者30min，测IκBα磷酸化及其降解状况。结果如图2，3所示，与对照组相比TNFα处理5min或30min后IκBα被磷酸化，并且由于降解其含量明显减少。然而GbE预处理组和未处理组相比较，IκBα减少未见明显差异（图2～3）。
图2 免疫印迹检测GbE预处理10h后的Hela细胞中TNFα诱导IκBα磷酸化与降解的变化（略）
Fig 2 Western Blotting analysis for TNFα-induced IκBα activation in Hela cells pre-treated with GbE for 10 hr
图3 免疫印迹检测GbE预处理26h后的Hela细胞中TNFα诱导IκBα的活性变化（略）
Fig 3 Western Blotting analysis for TNFα-induced IκBα activation in Hela cells pre- treated with GbE for 26 hr
HL-60细胞是早幼粒白血病细胞，具有嗜酸性粒细胞特性及向嗜酸性粒细胞分化的潜能。因此，HL-60细胞是模拟体内嗜酸性粒细胞生物功能的理想工具细胞。以GbE预处理HL-60细胞10～26h，加入TNFα诱导30min后收集细胞。结果如图4～5所示，与对照组相比TNFα处理后IκBα被磷酸化，并且由于降解其含量明显减少。然而GbE预处理组和未处理组相比较，IκBα减少未见明显差异，提示GbE的预处理无论时间长短对于TNFα激活的IκBα活性化皆没有显著抑制作用。
图4 免疫印迹检测GbE预处理10h后的HL-60细胞中TNFα诱导IκBα的活性变化（略）
Fig 4 Western Blotting analysis for TNFα-induced IκBα activation in HL-60 cells pre－treated with GbE for 10 hr
图5 免疫印迹检测GbE预处理26h后的HL-60细胞中TNFα诱导IκBα的活性变化（略）
Fig 5 Western Blotting analysis for TNFα-induced IκBα activation in HL-60 cells pre-treated with GbE for 26 hr
2.2.2 荧光素酶结果分析 将Hela细胞和HL-60细胞分别设为四组，依次是空白组（共转染内参和p-TALluc的细胞）、GbE处理组、TNFα刺激组和GbE+TNFα刺激组。各实验组共转染内参和pNF-κB-Luc，每组三个复孔。如图6所示，TNFα刺激组荧光素酶活性高于空白组4 -5倍，当用GbE预处理后荧光素酶的活性显著降低。提示GbE可抑制由TNFα诱导的NF-κB基因转录活性。
图6 荧光素酶活性分析检测GbE预处理后诱导的NF-κB活性改变（略）
Fig 6 Luciferase activity assay for TNFα-induced NF-κB activity in cells pre-treated with GbE
3 讨论
已有研究证实，哮喘性炎症与肺细胞中NF-κB的活性增加密切相关。可调节NF-κB活性的蛋白包括细胞因子，趋化因子，生长因子，黏附因子，氧化应激相关酶等［5］，其中最为人们所知的是TNFα。近年来，研究表明NF-κB的过度活性化与哮喘患者外周血及气道内嗜酸性粒细胞均明显增多有着密切关系［6］。An－Soo jang等发现氨茶碱可通过促进嗜酸性粒细胞凋亡而发挥治疗哮喘发作的作用。而且患者体内TNFα的水平明显高于正常人群。由此认为，通过抑制NF-κB的过度激活，干扰嗜酸性粒细在气道局部的聚集的过程，能够达到缓解、治疗哮喘发作的目的。在临床研究中人们发现，给予GbE治疗可明显改善患者肺功能，缓解症状，同时外周血及气道内嗜酸性粒细胞数量也明显降低，提示GbE有可能是通过干扰NF-κB的过度活性化而发挥作用。本研究证实细胞经GbE处理后，可显著拮抗TNFα诱导的NF-κB的转录激活作用，而这种拮抗作用很可能是GbE缓解、治疗哮喘发作的重要机制。
NF-κB通常是以二聚体形式与目的基因的启动子或增强子相应的DNA位点结合的，这种二聚体一般是由两种Rel家族蛋白构成，它包括两个亚基p65（RelA）和p50（NF-Kb1）。在这种NF-κB异源二聚体中，仅p65亚单位含有kB序列反式激活区域，可以直接作用于转录元件。在静息细胞胞质中 ，NF-κB与其抑制物IκBα结合在一起，IκBα的C末端含有多个丝氨酸残基的ankyrin重复片段 ，使之能与NF-κB的核位置信号肽区域（NLS）结合阻止NF-κB向细胞核内转移。当细胞受到刺激时，例如TNFα，嗜酸性粒细胞趋化因子等可引起IκBα磷酸化，磷酸化的IκBα可迅速被26S蛋白酶复合体降解，使NF-κB/IκBα分离，从而暴露出NF-κB核位置信号肽区域，促使核内转移，激活转录特定基因的表达。我们实验发现，用GbE处理细胞并不能拮抗TNFα诱导的IκBα的磷酸化和降解，将处理细胞时间延长至24h以上也不能出现拮抗现象。同样，提高处理细胞GbE的浓度，甚至达到1：10时GbE仍然不能抑制TNFα诱导的IκBα的磷酸化和降解。因此，可以认为GbE抑制NF-κB激活的基因转录并不是通过干扰经典的IKK/NIK/IκBα活化途径，而是通过干扰其它途径或采用其它方式来实现的。
NF-κB活化基因转录是一种十分复杂的过程，包括去除IκBα阻遏，核内转运，二聚体的形成以及选择性结合DNA等环节。GbE可通过干扰其中一种或多种环节实现抑制NF-κB介导的转录激活。例如孕烷X受体（PXR）是一种核受体亚家族的成员［7］，PXR被活化后，可以与NF-κB的p65亚基结合，抑制NF-κB二聚体的形成，从而阻遏NF-κB与DNA的结合所引起的基因转录。已有诸多研究证实，PXR能被多种处方药、中草药等亲脂性物质所激活，而GbE的主要成分也同样为亲脂性物质。分析GbE的亲脂性物质可以发现其成分中黄铜甙可达35％以上，总萜内酯可达10％以上，其中白果内酯可3.5％以上。GbE是否通过促使PXR活化而抑制NF-κB诱发的基因转录值得进一步深入研究。
【参考文献】
［1］ Dae-won Jeong, Min-Hyuk Yoo, Tae Soo Kim, et al. Protection of mice from allergen-induced asthma by selenite［J］. J.Biol.Chem,2002,277(20):17871～17876.
［2］ James H. Steer, Karen M.Kroeger, LawrenceJ.Abraham, et al . Glucocorticoids suppress tumor necrosis factor-a expression by human momocytic THP-1 cells by suppressing transactivation through adjacent NF-κB and c-Jun-activating transcription factor-2 binding sites in the promoter［J］. J. Biol. Chem., 2003,139:163～171.
［3］ 陈伟宁，曾爱红，马广伟，等.动态观察哮喘急性发作患儿血清IL-18和TNF-α改变的临床意义［J］.热带医学杂志，2005，5（2）：176～178.
［4］ Ishii S, Nagase T, Shindou H, et al. Platelet-activating factor receptor develops airway hyperresponsiveness independently of airway inflammation in a murine asthma model［J］. J Immunol,2004,172(11):7095.
［5］ Yasui K, Nakazawa T, Agematsu K. Theophylline accelerates human granulocyte apoptosis not via phosphodiesterase inhibition［J］. J Clin Invest,1997,100(7):1677～1684.
［6］ Woolly KL, Gibson PC. Eosinophil apoptosis and the resolution of airway inflammation in asthma［J］. Am J Respir Care Med,1996,154(1):237～243.
［7］ Zhang J, Kuchlp.Green ED, et al. The human pregnane X receptor:genomic structure and identification and functional characterization of natural allelic variants［J］. Phamacogenetics,2001,11:555～572.
作者单位：广州市第一人民医院检验科，广东 广州 510180；中山大学药学院微生物与生化制药实验室，广东 广州 510080.