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【摘要】 目的 研究外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg细胞)数量改变所致的细胞免疫抑制效应在慢性湿疹发病机制中的作用。 方法 采用免疫荧光标染技术，经流式细胞仪检测30例慢性湿疹患者和33例正常人外周血CD4+CD25+ T细胞数量及胞内转录因子Foxp3(forkhead box p3)表达水平。 结果 慢性湿疹患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量比正常人对照组明显下降(P<0.001)。 结论 慢性湿疹患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞数量下降导致参与IV型变态反应的效应性T细胞功能活性增强,这可能是湿疹发病机制之一。
【关键词】 湿疹 慢性 T淋巴细胞 Foxp3
Detection of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells in peripheral blood of patients with chronic eczema.
HUANG Jie, QIAN Qi-feng, LU Chuang-lin.
(Donghu Hospital of Shenzhen City, Shenzhen 518020, Guangdong; Shenzhen Municipal Institute of Dermatosis, Shenzhen 518020, Guangdong, P. R.China)
Abstract：Objective To investigate the suppressive effects of peripheral CD4+CD25+ Foxp3+ regulatory T cells (Tregs) on cell immunity in the pathogenesis of chronic eczema. Methods The expression of transcription factor Foxp3 and inhibitory membrane molecules, e.g. cytotoxic T lypmphacyte associated antigen-4 (CTLA-4), glucocorticoid-induced TNF receptor family-related gene( GITR) and programmed death-1(PD-1) were determined by three-color flow cytometry in peripheral CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells in peripheral bloood of 30 patients with chronic eczema and 33 normal controls. Highly purified CD4+CD25+T cells were obtained from peripheral blood by using immunomagnetic beads, and the production of intracellular suppressor cytokines such as interleukin-10(IL-10) and transforming growth factor-β (TGF-β) was determined by cytometry. Results The quantity of CD4+CD25+Foxp3+ Tregs was decreased significantly in peripheral blood of patients with chronic eczema (5.0%±1.0%) in comparison with that of normal controls(6.4%±2.1%)(P<0.001).The expressions of CTLA-4,GITR and PD-1 was significantly stronger in patients (2.8%±1.3%,12.7%±2.5% and 1.9%±1.1%,respectively) than that of the controls(1.3%±1.0%,9.5%±2.4% and 1.3%±0.6%,respectively （P<0.001, P<0.001 and P<0.01,respectively). Conclusion Herpes simplex virus infection may result in the activation and proliferation of CD4+CD25+ Tregs, the expression of high levels negative costimulatory molecules on the cell surface and secretion of suppressive cytokines, which may lead to the inhibition of antiviral immune responses via multiple mechanisms.
Key words：Eczema; Chronic; T-lymphocytes; Foxp3
CD4+CD25+调节性T细胞(Treg细胞)是近几年来确定的一类T细胞亚群,在维持机体免疫自稳、调控免疫应答方面起重要作用,其涉及变态反应、抗感染免疫、肿瘤免疫等许多病理性免疫过程。慢性湿疹是由多种内外因素引起的以苔藓样变为主，易反复发作的慢性炎症性皮肤病，其发病机制复杂且尚未完全阐明,传统观念认为由Ⅳ型变态反应介导，众多的炎症细胞和炎症因子参与其发病。为阐明慢性湿疹患者发病的可能机制,检测Treg细胞分化发育和功能维持中起重要作用的转录因子Foxp3(forkhead box p3)［1］的表达水平，以探讨CD4+CD25+ Treg细胞数量改变在慢性湿疹发病机制中的作用。
1 对象与方法
1.1 对象 30慢性湿疹患者均具有典型皮损并经病理证实符合诊断标准［2］：(1)病程2月以上；(2)皮损呈多形性，弥漫性，对称分布，急性期有渗出，慢性者有浸润肥厚；(3)常反复发作，瘙痒剧烈；(4)病理学上有棘层肥厚，角化过度，炎性细胞浸润等。所有患者均无合并其他变态反应性疾病，近1个月未系统使用糖皮质激素或免疫抑制剂,近1周未使用抗组胺药及外用糖皮质激素制剂。其中男17例，女13例，年龄17～60岁，平均36．1岁。病史3个月至11年,平均2.4年; 正常人对照组33例,男20例,女13例;年龄18～48岁,平均29.9岁。
1.2 方法
1.2.1 试剂和仪器设备 抗人CD4-PerCP、CD25-FITC、CD25-PE单抗及同型对照小鼠IgG1抗体购自美国Becton Dickinson 公司; PE标记的抗人Foxp3胞内染色试剂盒购自美国eBioscience 公司; Nycoprep密度梯度分离液由挪威Axis-Shield 公司提供;流式细胞仪为美国BD公司产品,型号FACSCalibur。
1.2.2 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞染色:从肝素抗凝全血中经密度梯度离心法分离外周血单一核细胞(PBMC),调整细胞为1×106/ml,取100μl细胞悬液(1×105细胞)加入抗CD4-PerCP、CD25-FITC单抗各10μl,室温避光染色20min后,用染色缓冲液洗涤1次,加入新配制的固定/透膜液1mL,4℃暗处孵育30～60min,加2ml透膜缓冲液洗涤2次,离心弃上清,加2%正常大鼠血清100μl,4℃避光封闭15min,以阻断膜表面Fc受体,减少非特异性荧光吸附,再加入PE标记抗人Foxp3(克隆号PCH101)抗体10μl,4℃避光孵育30min,洗涤2次,然后加入适量的染色缓冲液混匀,用流式细胞仪收集30 000个细胞/管,CellQuest软件获取并分析数据,以三色荧光抗体染色阳性细胞百分率记录结果。
1.2.3 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件进行分析,所有数据均以x±s表示,组间均数比较采用独立样本的t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
正常人外周血CD4+CD25+T细胞占CD4+细胞比例为5.75%～19.81%,平均(11.4±2.8)%;在CD4+CD25+T细胞中,Foxp3阳性表达比例为33.7%～87.1%,平均(56.2±14.3)%。慢性湿疹患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+CD25+ T细胞比例为30.8%～77.9%,平均(48.7±1.8)%。慢性湿疹患者CD4+CD25+ T细胞、转录因子Foxp3表达均比对照组明显下降,见表1。正常人与慢性湿疹患者组比较，Foxp3表达比例差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
表1 慢性湿疹患者外周血CD4+CD25+ T细胞Foxp3表达水平（略）
表2 慢性湿疹患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+CD25+ T细胞比例（略）
3 讨论
1995年Sakaguchi等［3］首次报道CD4+CD25+ Treg细胞后即引起广泛关注。目前研究发现，该细胞来源于胸腺,大约占正常人外周血CD4+T细胞数的5%～10%;细胞表面表达CD25(IL-2受体α链)、CTLA-4、GITR和PD-1等膜分子,其特征性的分子标记是Foxp3［4］。随后体外研究还发现，CD4+CD25+ Treg细胞同时具有免疫无能和免疫抑制两大功能特征。我们实验结果为正常人外周血CD4+CD25+ T细胞占CD4+ T细胞的11.4%，用PE荧光标记的抗人Foxp3单抗与胞内Foxp3结合,通过流式细胞仪从单细胞水平上研究Treg细胞,发现在CD4+CD25+ T细胞中, Foxp3表达比例平均为56.2%,与Roncador等［5］报道的55％相近，该方法又一次证实了只有CD4+CD25+ Foxp3+ T细胞而非CD4+CD25+ Foxp3-T细胞具有免疫调节功能,前者才是真正意义上的Treg细胞,可见CD4+CD25+ Treg细胞功能的维持有赖于Foxp3的存在。
【参考文献】
［1］ Fontenot JD,Rasmussen JP,Williams LM et al. Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor Foxp3［J］.Immunity, 2005,22:329～341.
［2］ 赵辨．临床皮肤病学［M］．第3版．南京：江苏科学技术出版社，2001,604～607.
［3］ Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M, et al. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases［J］.J Immunol,1995,155:1151～1164.
［4］ Nagler-Anderson C,Bhan AK,Podolsky DK,et al. Control freaks:immune regulatory cells［J］.Nat Immunol,2004,5:119～122.
［5］ Roncador G,Brown PJ,Maestre L,et al. Analysis of Foxp3 protein expression in human CD4+CD25+regulatory T cells at the single-cell level［J］.Eur J Immunol,2005,35:1681～1691.
作者单位：深圳市东湖医院皮肤科，广东 深圳 518020； 深圳市皮肤病研究所，广东 深圳 518020.