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【摘要】 目的 研究银屑病患者皮损内信号转导和转录激活因子4(STAT4)的表达及其临床意义。 方法 利用荧光定量聚合酶链反应法测定20例寻常型银屑病患者皮损内及17例正常对照者皮肤中STAT4mRNA的定量表达，采用直线相关回归分析方法分析STAT4mRNA的表达与银屑病病情严重指数（PASI）的关系。 结果 银屑病患者皮损内STAT4mRNA高于正常对照者皮肤内的表达水平（P＝0.0016）。其表达与患者病情严重程度呈显著的正相关(r=0.78465, P<0.0001)。 结论 STAT4可能在银屑病的发病中其重要作用。
【关键词】 银屑病 信号转导和转录激活因子4 荧光定量聚合酶链反应
Expression and significance of STAT4 mRNA in patient with psoriasis vulgaris.
MA Ze-Lin, ZHOU Zhi-Gang, LI Chang-xing,et al.
（Dongguan Municipal Hospital of Chronic Diseases, Dongguan 523008, Guangdong, P. R. China）
Abstract：Objective To investigate the expression and significance of signal transducers and activators of transcription 4 (STAT4) in psoriatic lesional skin. Methods Twenty adult patients with psoriasis vulgaris and 17 health controls were sequentially enrolled in this study. The quantitative expression of STAT mRNA was determined by real-time polymerase chain reaction. The relationship between STAT and disease severity(PASI) was assessed by correlation analysis. Results Expression of STAT mRNA in psoriasis lesional skin was higher than that of control subjects （P＝0.0016）. Expression of STAT mRNA was markedly positively correlated with that of PASI (r=0.78465, P<0.0001). Conclusion STAT may play an important role in the development and advance of psoriasis vulgaris.
Key words：Psoriasis vulgaris; Signal transducers and activators of transcription 4; Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)
银屑病是一种慢性炎症性增生性疾病，严重影响着患者的生活质量，人群发病率为0.5%～4.0%，其发病机制可能与遗传、细胞因子及其受体、新生血管形成、细胞凋亡异常等有关［1～3］。信号转导和转录激活因子(Signal transducers and activators of transcription, STAT)蛋白家族是近年来发现的一类转录因子，包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6等7个成员［4］。STAT家族作为转录因子和细胞因子发生作用的信号通路，正日益受到人们的关注，但STAT在银屑病中的表达情况及其临床意义的研究甚少。本研究采用荧光定量PCR法定量测定STAT4在银屑病患者皮损内的表达及探讨其临床意义，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料 20例寻常型银屑病患者为2006年1～6月东莞市慢性病防治院皮肤科门诊患者（进行期）,其中男11例，女9例；年龄范围20～46岁（平均36.8岁）；病程10d～3年。所有患者治疗前2个月内未系统应用免疫抑制剂或皮质类固醇制剂或中药机制；银屑病皮损严重指数（PASI）为8.9～48.6（平均30.1）。正常对照者17例为健康者外科整形手术切除的皮肤，其中男9例，女8例,年龄范围20～46岁（平均36.8岁）。
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取 组织块置匀浆器，加TRIZol冷冻匀浆，提取后的RNA，-80℃保存备用。
1.2.2 RNA样品鉴定 电泳检查：每样品取5μl RNA置1%的琼脂糖凝胶上电泳，泳毕，溴化乙锭染色20min，置紫外灯下观察。紫外分光光度计测吸光度值及计算样品浓度。
1.2.3 引物的设计和合成 参考16sRND基因文库设计引物，STAT4引物序列如下：FO: 5’- CAT TTG GTA CAA CGT GTC AAC CA -3’，RO: 5’- TGT GGC AGG TGG AGG ATT ATT A -3’,引物扩增片断长度为70bp，TaqMan Probe: 5’-FAM- CGA TTC CCA GAA CTT GGT TTT CT -TAMRA-3’，由ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成。
1.2.4 逆转录反应 取4μl RNA模板做逆转录反应，仪器为PE9700PCR仪，反应体系如下： 5×逆转录buffer 4μl,上游引物（10pM/μl）0.4μl,下游引物（10pM/μl）0.4μl, dNTPs（25mM）0.2μl, MMLV（10U/μl）1μl, DEPC水10μl,总体积20μl。反应条件：37℃ 1h，然后95℃ 3min。
1.2.5 荧光定量PCR反应体系进行 由荧光定量仪PE 7000型PCR扩增仪扩增完成。反应体积为50μl，反应体系：5×定量PCR buffer 10μl,上游引物F1μl，下游引物R 1μl，dNTPs 0.5μl，荧光探针1μl，Taq 酶1.5μl，cDNA 5μl，ddH2O 30μl。反应条件为：93℃ 2min，然后93℃ 45秒，55℃ 45秒，共40个循环。反应结束后，计算待测样本STAT4 mRNA表达量(copy/μg RNA)。
1.2.6 统计学分析 采用SAS 8.01 for window 统计软件进行统计分析，组间比较采用秩和检验和直线相关回归分析。
2 结果
2.1 银屑病患者皮损内STAT4 mRNA的表达明显高于正常对照者皮肤中的表达,见表1。
表1 银屑病治疗前皮损和正常皮肤内STAT4 mRNA的表达（略）
2.2 银屑病中STAT4mRNA表达与病情PASI的呈显著正相关性(r=0.78465,P<0.0001)。
3 讨论
银屑病组织病理学主要特征是角质形成细胞过度增生、炎症细胞浸润、新生血管形成［2,3］。银屑病患者外周血Th细胞分化呈偏态性，以Th1细胞为主［1］，Th1细胞主要分泌IFN－γ等细胞因子，患者皮损内IFN－γ过度表达促进了炎症细胞浸润和新生血管形成，进而形成银屑病皮损［2,3］。但银屑病患者体内是通过何种信号途径促进Th细胞分化呈偏态性，如何促进IFN－γ过度表达的研究甚少。STAT4是T细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬／枯否细胞等免疫调控细胞内IL-12／STAT4／IFN－γ信号传导途径的关键组成元件，是IL-12诱导免疫调控细胞产生IFN－γ的关键调控因子。在STAT4基因敲除小鼠，IL-12诱发的所有主要的T细胞和NK细胞功能反应均明显减弱，其中包括IFN－γ产生减少与Th1型反应减弱；除此以外，STAT4还能调控T细胞IL-12受体和IL-18受体表达以及T细胞NF-κB激活［5,6］。因此，STAT4作为IFN－γ产生的关卡，通过直接与间接途径调控IFN－γ的产生。本研究发现银屑病患者和健康者皮肤均有STAT4mRNA的表达，但银屑病患者的表达量明显高于健康对照者，与Eriksen等人［7］报道的基本一致。此外，银屑病患者皮损内STAT4mRNA的表达与病情严重程度呈显著的正相关，即STAT4mRNA的表达量越高其病情越重，反之亦然。这些研究结果表明，银屑病患者STAT的过度表达可能直接与间接促进IFN－γ的表达，进而促进了炎症细胞浸润和新生血管形成，最终形成银屑病皮损。
【参考文献】
［1］ 张锡宝,何玉清,吴志华,等. 银屑病患者外周血CD4+T细胞内干扰素γ、白介素4表达与发病的关系［J］. 中华皮肤科杂志, 2003,36(3):151～153.
［2］ 李常兴, 张锡宝, 吴志华,等. 甲氨蝶呤对银屑病患者皮损内VEGFmRNA影响的研究［J］. 中国皮肤性病学杂志, 2005,19(9):522～524.
［3］ 张锡宝,李常兴, 何玉清. 甲氨蝶呤对银屑病患者皮损T细胞内IFN-γmRNA影响的研究［J］. 中国皮肤性病学杂志, 2005,19(10):592～595.
［4］ Levy DE, Darnell JE Jr. Stats: transcriptional control and biological impact［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002, 3(9):651～562.
［5］ Lawless VA, Zhang SM, Ozes ON, et al. STAT4 regulates multiple components of IFN- inducing signaling pathways［J］. J Immunology, 2000,165(12):6803～6808.
［6］ Fukao T, Frucht DM, Yap G, et al. Inducible expression of Stat4 in dendritic cells and macrophages and its critical role in innate and adaptive immune responses［J］. J Immunology, 2001,166(7):4446～4455.
［7］ Eriksen KW, Lovato P, Skov L. Increased sensitivity to interferon-alpha in psoriatic T cells［J］. J Invest Dermatol, 2005, 125(5):936～944.
作者单位：东莞市慢性病防治院,广东 东莞 523008; 中山大学达安基因诊断中心,广东 广州 510080.