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【关键词】 宫颈癌;病因;检测;预防
Advance in the research of etiological causes and detection and prevention of cervical cancer.
GUO Jie, ZHU Zhong-yuan, WANG Hai-bo, et al.
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101, Hainan, P. R. China）
宫颈癌是威胁女性生命的第二大癌症，全球每年新发宫颈癌病例达47万，其中23.3万人病死［1］。然而，宫颈癌又是一种可以预防的疾病，因为高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus, HPV）的感染，特别是HPV16/18型的感染，是宫颈癌的主要致病因素。因此，现就对于宫颈癌的产生起到重要作用的HPV16/18型的致癌机理，宫颈癌和HPV的检测及预防展开讨论。
1 宫颈癌与HPV16/18具有相关性
1.1 从宫颈癌组织中提取HPV DNA的证据 1999年，Bernhard在180个宫颈癌患者的标本里，检测出其中感染HPV16/18 的标本数占到了总标本数的70% ，说明大部分宫颈癌患者的体内都感染了HPV16/18［2］。对我国不同地区宫颈癌组织及其癌前病变组织进行HPV检测，约80%以上的宫颈癌组织及其癌前病变中含有HPV基因，而且以高危型HPV16为主［3］。HPV16、18感染与宫颈癌、膀胱癌的发生密切相关，与子宫内膜癌、阴茎癌的发生也有一定的联系，也就是HPV16、18与泌尿生殖系统的肿瘤具有相关性。通过PCR技术或者原位杂交等技术均可从这些癌症的组织里分离出HPV16/18 DNA［4］。
1.2 从细胞学检测中得到的证据 因为HPV具有嗜上皮性，一般来说，大部分HPV的感染在临床上并无症状出现，但是它却预示着宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia，CIN）的存在（CIN可分为3个等级：CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ）［5］,后两个等级发生宫颈癌的可能性极高，因此可以通过对宫颈细胞病变程度的检测证明HPV与宫颈细胞癌变是相互关联的。目前仍广泛使用的观察宫颈细胞病变的方法是巴氏涂片法。Mandelblatt等研究表明，每2、3年单独检测HPV用于宫颈癌筛查，与传统的单独巴氏涂片细胞学检查有同样的特异性，且更敏感、更经济［5］。因此定期对宫颈分泌物做HPV检测，是预防宫颈癌的一种有效的手段。这也从细胞学的角度为HPV与宫颈癌的相关性提供了证据。
1.3 从致瘤机理中得到的证据 总结HPV16/18的致癌机理可以总结出以下几点：①HPV16/18中的E6/E7两种蛋白是与癌症的发生关系最为密切的两种蛋白。②HPV16/18在恶性肿瘤中E6/E7与细胞是处于整合状态的，直接对宿主细胞起作用。③E6/E7 可以激活一些细胞癌基因，以及可以抑制一些抑癌基因发生作用，而使细胞向无限增殖的方向发展。④HPV16/18还与其他一些因素有关。
2 HPV与致癌相关的分子或基因
HPV是一个直径为55nm，无包膜的DNA病毒。它具有二十面体的病毒衣壳。病毒衣壳包括两种衣壳蛋白，L1（主衣壳蛋白）和L2（次衣壳蛋白） 。HPV DNA按照功能可划分为三个区： 长控制区（LCR）、早期转录区（ER）和晚期转录区（LR）。其中在ER中存在与复制和癌发生有关的6种蛋白：E1、E2、E4、E5、E6和E7。而E6和E7的表达可以使细胞由正常状态转变为恶性增殖状态，这也就导致了细胞的癌变。正是由于这两种蛋白对正常细胞产生的作用，科研工作者对这两个蛋白的研究也是最为重视的。成海恩等采用RNA干扰（RNA interference，RANi）技术，沉默宫颈癌CaSki细胞株中HPV E6基因的表达，发现E6的沉默导致细胞内P53蛋白的聚集，反式激活细胞周期调控基因p21，减少细胞的生长,进而探讨该方法在治疗宫颈癌中的意义［6］。贾英等研究HPV16 E7和Brn-3a（细胞转录因子）在各级CIN中的表达情况以及两者之间的关系，从分子生物学水平探讨其作为宫颈癌前病变的特异性标志物的可能性，以期寻找新的宫颈癌前病变筛查方法［7］。
3 HPV16/18的致瘤机理
3.1 E6/E7的表达能够对细胞周期调节蛋白产生影响 马翠玲等就对HPV16 E6/E7对人角质形成细胞周期素（Cyclin A、Cyclin D1）及细胞周期素依赖性激素（cdK4）的影响做了深入的研究。结果发现，HPV16 E6/E7能对细胞的增殖产生影响，同时细胞周期调节蛋白Cyclin A、Cyclin D1及cdK4的表达异常，而且这些蛋白表达异常时是发生在转染的早期，进而使细胞处于无限增殖的状态，产生癌变［8］。
3.2 E6/E7的表达可以激活端粒酶 90年代初，就有人发现细胞癌变与端粒酶的激活关系密切，而HPV16/18也是通过E6/E7两种蛋白增加端粒酶催化亚单位的转录来激活端粒酶的［9］。
3.3 E6的表达可以抑制脆性组氨酸三联体（FHIT）这种抑癌基因的表达，而使p53基因产生过表达：在正常细胞内p53基因可以在染色体损伤后停止细胞的生长，而且可以刺激DNA修复酶进行修复工作。而当E6与p53结合后就能降解p53，而使基因造成突变，而使染色体损伤后继续细胞的无限增殖，就造成了癌变［10］。除此以外HPV感染对人体免疫系统也会产生影响：任莉等报道HPV的感染与Thl／Th2（辅助性T细胞的两种亚型）的漂移有关，使Th2型细胞因子水平增高，而又抑制了Th0向Th1分化，从而导致了HPV在体内的持续感染，使得细胞免疫降低，有助于其向癌变的方向发展［11］。
4 宫颈癌及HPV的筛查手段
4.1 细胞学的检测方法
4.1.1 Pap涂片法 Pap涂片法（Papanicolaou-stained）是以一个名为George Papanicolaou 的病理学家命名的一种方法。该方法于1949年出台时，对于宫颈癌的起因还尚不清楚，但该方法竟降低了17%的死亡率。因此该方法目前仍然是检测宫颈内细胞病变的主要方法。
4.1.2 阴道镜活检 采用电子阴道镜定位活检，在镜下可以准确的鉴别良恶性病变。是早期诊断宫颈癌的一种有效的方法［12］。
4.2 HPV DNA的检测方法
4.2.1 使用第二代基因杂交捕获信号放大检测系统Hybrid Capture（HCAII），配套使用HPV DNA的试剂，可以同时检测16／18／31／33／35／39／45／51／52／56／58／59／68共13种HPV病毒亚型。其结果是以相对的荧光光度单位值（Relative Light Units。RLUs）与阳性标准品的阈值（Cutof,CO）的比值比较。RLU／CO≥1．2为阳性，RLU／C0≤0．8为阴性，0．8～1．2为临界值。RLU／C0值越高，表示标本的病毒含量越高［13］。该方法是一种无辐射，相对快速的液基杂交的一种方法，该方法的好处不仅是能够检测出常见的HPV的亚型而且还能定量的检测出所含病毒的含量，为临床提供治疗的依据［14］。
4.2.2 PCR检测法
4.2.2.1 使用通用引物MY09和MY11扩增HPV L1 开放读写框（Open Reading Fragment ,ORF）E6/E7 中的450bp的片段,或者使用GP5+/GP6+引物对扩增HPV L1 ORF中的68bp的片段，该片段包含在上述的450bp内。这两种方法均可扩增出25种亚型的HPV［15］。
4.2.2.2 使用MY09/11引物对和GP5+/GP6+引物对对HPV DNA实行嵌套PCR方案（Nested Multiplex PCR，NMPCR），会比单用MY或单用GP引物对有更高的敏感性和特异性。NMPCR与上述两种方法的P<0.0002,差异具有极显著［15］。
4.2.2.3 HPV荧光偏振分型检测宫颈病变组织中HPV16/18型:使用通用引物GP5+／6+ 扩增L1基因中的高度保守的序列，其大小为150bp。在引物中掺入HPV16/18的特异性寡核苷酸探针和特异性荧光素标记碱基。再通过检测探针杂交后掺人的特异荧光素标记碱基的不同来判断病毒的类型［16］。
4.2.2.4 多重实时PCR检测HPV16:通过多重实时荧光定量PCR检测HPV16 E2、E6 DNA基因拷贝数，依据标准曲线计算每一待检标本的E2、E6基因拷贝数。重复检测2次，取E2和E6拷贝数的均值来计算E2／E6比值，根据该比值来判断HPV16的存在状态［17］。
4.2.3 基因芯片检测法 采用亚能生物技术（深圳）有限公司生产的人乳头瘤病毒分型基因芯片检测系统对提取的HPV DNA进行PCR扩增、杂交、洗膜及显色，再在基因芯片阅读仪上进行扫描，记录结果。该系统可以同时检测5种低危型和18种高危型的HPV亚型［18］。
4.2.4 PCR反向杂交点印记法 使用能够扩增L1区中大小仅为65bp的保守序列的引物—小片段扩增（Short PCR Fragment, SPF）引物,该引物可以检测出HPV的39种亚型。而在这65bp的序列中存在22bp的高度特异的序列，该序列可以区分HPV的各种亚型。使用这22bp的片段设计型特异探针，进行反向杂交实验，检验所感染的HPV的型别［2］。以上列举了临床上常用的宫颈癌及HPV的检测方法，然而，依据临床多变的病例，常常要把两方面的检测方法结合起来使用，才能达到“找准病因，治病救人”的目的。例如：非典型鳞状上皮细胞（ASCUS），被认为是诊断的“灰色”地带，也就是在细胞学中让临床医生最难下结论的一种细胞学病变。对于此病变的诊断方法就有人推荐将细胞学检查、阴道镜检查与HPV DNA检查结合起来使用，最终得出结论［19］。由此可见，随着医学的进步，以及诊断水平及方法的进步，许多疑难杂症都可以通过几种检测手段来得到确诊，为疾病的治疗争取到宝贵的时间。
5 宫颈癌及HPV的防治
随着科学的进步及对宫颈癌和HPV的深入研究，目前已有一种名为“加德西”的宫颈癌疫苗于2006年6月8日获准在美国上市。该疫苗主要针对HPV6/11/16/18 4种型别，而且可以提供5年的保护期。关于HPV疫苗，目前国际上已有两家公司已经研制出了HPV疫苗。其中Merck公司采用酵母表达系统制备的HPV L1病毒样颗粒疫苗已批准在美国上市，而且也批准其在其他一些国家上市。GSK公司采用杆状病毒／昆虫细胞系统表达的HPVL1病毒样颗粒疫苗正在进行III期临床试验，预计在2006年年底完成。同时GSK公司也向欧洲管理部门提出了上市申请，现正处于评审过程中。从流行病学的角度来讲,宫颈癌的发生除了与HPV的感染有关外,还与其他的外在因素有关，例如避孕药的使用、吸烟、以及有其他性传播病毒的感染。究其原因是糖皮质可以通过口服避孕药中类固醇激素来诱导癌症的发生，所以长期服用口服避孕药会提高宫颈癌的发病率；而吸烟会引起局部免疫力的降低和香烟成分中的诱变剂和激活剂也都已经在宫颈细胞中得到了证实，并且可能对HPV的存在产生影响或者有助于转变成恶性肿瘤；其他性传播病毒如：单纯疱疹病毒和人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）等病毒在宫颈癌的产生中起到了辅助作用。因此，为了有效的预防HPV感染及宫颈癌的产生，除了运用先进的检验手段和药物外，还必须养成良好的生活习惯，断绝病毒感染的潜在因素。
6 结语
本文就与宫颈癌的产生密切相关的HPV16/18型的致癌机理，宫颈癌与HPV的检测及它们的防治与预防等内容做了深入的探讨，但HPV仍然是威胁女性身体健康的一种病毒，在了解它的同时，各位医学工作者在治疗及预防HPV感染方面还需作出更大的努力。
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作者单位：中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南 海口 571101; 海南省农垦总局医院，海南 海口 570311； 南京大渊生物工程有限责任公司,江苏 南京 210000.