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【摘要】 目的 了解分离的阴沟肠杆菌耐药性及氨基糖苷类修饰酶、β-内酰胺酶相关基因存在状况,给防治提供参考。 方法 采用MicroScan微生物鉴定系统Neg Combo Panel Type 21阴性复合板微量肉汤法测定临床分离的20株阴沟肠杆菌对抗菌药物的敏感性，采用聚合酶链反应方法分析氨基糖苷类修饰酶及β-内酰胺酶编码基因。 结果 20株菌均呈严重多重耐药，仅对亚胺培南高度敏感（耐药率5.0%），哌拉西林／他唑巴坦耐药率50.0%，对包括3、4代头孢在内的其他β-内酰胺类及氨基糖苷类抗生素耐药率90.0%～100.0%,对复方新诺明耐药率100%；20株菌均检出氨基糖苷类修饰酶基因，未检出aac（3）-Ⅲ和aac（3）-Ⅳ基因；19株（95.0%）菌检出β-内酰胺酶相关基因，TEM和DHA基因阳性率均为70%，9株菌（45.0%）同时检出TEM和DHA基因，未检出SHV、OXA、PER、VEB和GES基因。 结论 广州地区医院感染阴沟肠杆菌多重耐药严重，氨基糖苷类修饰酶基因、DHA型质粒AmpC酶基因和TEM型β-内酰胺酶基因携带率高，在介导细菌耐药方面起重要作用。
【关键词】 阴沟肠杆菌；耐药性；β-内酰胺酶类；抗生素;氨基糖苷；基因
Investigation into the resistance and genotyping of aminoglycoside-modifying enzyme and β-lactamases in Enterobacter cloacae.
ZHI Zhi-quan, JIANG Guang-tian, XU Hai-ou, et al.
（Huadu District Hospital, Guangzhou 510800, Guangdong, P. R.China）
Abstract：Objective To investigate the status of drug resistance and genotyping of aminoglycoside-modifying enzymes（AMEs） and β-lactamases（BLs） in Enterobacter cloacae isolated from hospital infections in Guangzhou. Methods Microdilute tests were performed to identify the sensibility of 20 trains of Enterobacter cloacae to 20 bacteriophage by Dade MicroScan system. Genotypes of AMEs and BLs in strains of Enterobacter cloacae were analyzed by PCR. Results The 20 strains were multiresistant to bacteriophage except of IMP. The resistant rates to IMP, P/T and CP were 5.0%, 50.0% and 60.0% respectively. Most of the isolates （90.0%～100%） were resistant to aminoglycosides with the resistant rates to other antibiotics of from 90.0% to 100%. The 20 strains（100%） all carried one or more types of AMEs gene, including ant（3''）-Ⅰ（17 trains）, aac（6'）-Ⅰ（14 trains）, aac（3）-Ⅱ（10 trains）, aac（3）-Ⅰ（6 trains）, aac（6'）-Ⅱ（6 trains）, aph（3'）-Ⅵ（2 trains） and ant（2''）-Ⅰ（1 trains） . 19 strains（95.0%） carried the types of BLs gene, including blaTEM （14 trains） and blaDHA （14 trains） . Other 9 trains carried both blaTEM and blaDHA. The genes of blaSHV, blaOXA, blaPER, blaVER, blaGES,aac（3）-Ⅲand aac（3）-Ⅳ were not detected in none of the 20 trains of Enterobacter cloacae. Conclusion Enterobacter cloacae isolated from hospital infection were resistannt to multiple drugs. The carrying rates of Enterobacter cloacae with AMEs gene, BLs （blaTEM and blaDHA） were high in Guangzhou, suggesting that it may play a role in mediate the ocurrence of drug resistance in bacterium.
Key words：Enterobacter cloacae; Drug resistance; Multiple resistance; Beta-Lactamses; Antibiotics; Aminoglycoside; Genes
阴沟肠杆菌是医院感染的重要病原菌, 常导致严重的医院感染如下呼吸道感染、菌血症等，临床检出率呈上升趋势，同时呈现严重的多重耐药性［１～4］。阴沟肠杆菌对β-内酰胺类耐药主要是产生染色体介导的诱导型高产AmpC酶或持续去阻遏高产AmpC酶，也可同时或单独携带超广谱β-内酰胺酶（ESBLs），但对质粒介导的DHA型AmpC酶研究较少。同时，国内关于阴沟肠杆菌氨基糖苷类修饰酶（Aminoglycoside modifying enzymes,AMEs）基因研究的报道较少［４］。为了解本地区检出的阴沟肠杆菌中AMEs基因及β-内酰胺酶（Bla）基因存在状况，笔者对从本院临床分离的20株阴沟肠杆菌进行了药敏试验，并检测了9种AMEs基因和7种Bla基因，报道如下。
1 材料与方法
1.1 菌株来源及鉴定 20株阴沟肠杆菌为随机抽取的不重复菌株，均为2003年9月～2004年12月住院医院感染病人各种标本（痰液17份,创面分泌物、皮肤坏死组织和中段尿各1份）分离得。采用MicroScan微生物鉴定系统Neg Combo Panel Type 21阴性复合板鉴定菌株。标准菌株为大肠埃希菌（ATCC25922）、大肠埃希氏菌（ATCC35218）和铜绿假单胞菌（ATCC27853）。
1.2 药敏试验 微量肉汤法稀释法，采用MicroScan微生物鉴定系统Neg Combo Panel Type 21阴性复合板检测菌株对20种抗菌药物的敏感性，根据2006年版CLSI文件标准判断结果。
1.3 AMEs基因及Bla基因检测 采用聚合酶链反应（PCR）法，以蛋白酶K消化法制备DNA扩增模板。9种AMEs基因PCR扩增引物序列及产物长度见表１［５］。7种Bla基因PCR扩增引物序列及产物长度见表2。各种靶基因PCR扩增体系均为：每反应体系P1、P2引物各0.5μmol/L,KCl 10mmol/L,（NH4）2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，Tris-HCl（pH9.0）10mmol/L，NP40 0.5%，Taq DNA pol 1U。总反应体积20μl（其中模板液5μl）。热循环参数均为：93℃预变性2min，然后93℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s，循环35周期，最后72℃延长5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色,紫外灯下观察结果,出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性，并拍照保存。阳性对照基因均由无锡市克隆遗传技术研究所筛查获得，并经测序证实。纯水为阴性对照。
表1 氨基糖苷类修饰酶基因PCR引物序列（略）
表2 7种β内酰胺类抗生素相关耐药基因PCR引物序列（略）
2 结果
2.1 药敏试验结果 本组菌株呈严重多重耐药性，仅对亚胺培南高度敏感，见表3。
表3 20株阴沟肠杆菌对20种抗菌药物的敏感性（略）
2.2 9种AMEs基因PCR检测结果 见表4。图1为aac（3）-Ⅰ、aac（3）-Ⅱ、aac（6'）-Ⅰ、aac（6'）-Ⅱ和ant（3''）-ⅠPCR产物电泳图。
表4 20株阴沟肠杆菌氨基糖苷类修饰酶基因检测结果（略）
2.3 7种Bla基因PCR检测结果 共有19株菌检出Bla基因，检出TEM和DHA基因的各有14株菌，同时检出TEM和DHA的有9株，未检出SHV、OXA、PER、VEB和GES基因。见图2。
3 讨论
产ESBLs和高产AmpC酶在革兰阴性杆菌耐药机制中具有重要意义。阴沟肠杆菌对β-内酰胺类的耐药机制复杂，主要有产ESBLs、高产AmpC酶、同时产ESBLs和AmpC酶、外膜通道蛋白缺失［6，7］等。AmpC酶不但具有ESBLs的水解能力，还对头霉素类和酶抑制剂稳定。AmpC酶有持续低产AmpC酶、诱导型高产AmpC酶和去阻遏持续高产AmpC酶三种，前两种AmpC酶由染色体介导，后者由染色体或质粒介导。由质粒介导的AmpC酶容易在菌株间传递，对临床的危害极大，目前报道的质粒AmpC酶达20余种［8］。阴沟肠杆菌能单独或同时产ESBLs和AmpC酶，导致其耐药问题变得更加严重，也增加了对其耐药性分析的难度。国内报道的阴沟肠杆菌ESBLs基因型有TEM、CTX-M、SHV、PER 、VEB等［7，9，10］，除TEM外，其他基因检出率均较低。本研究仅检出TEM型基因，阳性率为70%。有70%（14/20）的菌株检出质粒介导的DHA型ampC基因。5株单纯TEM型Bla基因阳性菌亚胺培南（IMP）均敏感，有2株对哌拉西林/他唑巴坦（P/T）耐药，4株对头孢他啶（CAZ）耐药，对其他Ⅰ～Ⅳ代头孢菌素、氨曲南（AZT）及阿莫西林／克拉维酸全耐药，存在TEM酶的大量产生或产其他AmpC酶的可能；5株菌单纯DHA基因阳性，IMP均敏感，对P/T敏感和中介各1株，对其余的β-内酰胺类均耐药；9株菌同时检出TEM和DHA基因，其中耐IMP 1株，P/T敏感4株，头孢吡肟（CPE）敏感2株（均对P/T敏感，其中1株对头孢曲松（CAX）和AZT敏感）；1株未检出Bla基因但对AZT、CAX、头孢噻肟（CFT）和CPE均耐药，对P/T和CAZ敏感，其机制有待研究，可能存在未能检测的亚型。14株检出DHA基因的菌株中有6株对P/T敏感，说明他唑巴坦对DHA型AmpC酶具有一定的活性。通常认为CPE对Bush I组AmpC酶稳定而能被ESBLs水解，5株单纯DHA基因阳性菌对CPE均耐药，DHA基因阳性菌对CPE敏感的仅有2株,且均检出TEM和DHA，对P/T敏感，CAZ、CFT耐药。
a:aac（3）-ⅠPCR产物电泳图 b:aac（3）-ⅡPCR产物电泳图 c:aac（6'）-ⅠPCR产物电泳图 d:aac（6'）-ⅡPCR产物电泳图 e: ant（3”）-I PCR产物电泳图
图1 5种阳性AMEs基因PCR产物电泳图（略）
注：M：分子量标记，由上而下分别为50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000bp；P： 阳性对照；N： 阴性对照；S：阳性标本。
a: TEM基因PCR电泳图 b: DHA 基因PCR电泳图
图2 TEM及DHA基因PCR产物电泳图（略）
注：M：分子量标记,由上而下分别为50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000bp；P： 阳性对照；N：阴性对照；S：阳性标本。
可见，携带并表达DHA基因在阴沟肠杆菌耐酶抑制剂机制中具有重要意义。阴沟肠杆菌同时携带ESBLs和AmpC酶不但使其耐药性更加复杂，更增加了对其耐药表型分析的难度。本研究未对其他质粒介导和染色体介导ampC基因及其调控基因以及外膜通道蛋白进行检测，不能排除这些耐药机制对细菌耐药性的影响。氨基糖苷类抗生素对有氧生长革兰阴性杆菌具有高度抗菌活性，常联合β-内酰胺类用于革兰阴性杆菌引起的严重感染。国内细菌耐药性监测资料显示，革兰阴性杆菌对氨基糖苷类抗生素耐药性日趋严重［１～３］。细菌对氨基糖苷类抗生素耐药机制有先天性耐药和获得性耐药。两者均可由膜孔蛋白介导的药物摄入降低所致，引起对所有氨基糖苷类的交叉耐药。获得性耐药还可由存在于质粒和转座子的耐药基因编码氨基糖苷类修饰酶（AMEs）修饰并灭活抗生素、染色体突变引起核糖体靶位的修饰改变所致。由于编码AMEs的基因为可移动的遗传片段，可以在不同菌群中水平转移，因此在氨基糖苷类耐药机制中具有重要意义。AMEs分为乙酰转移酶（AAC）、核苷转移酶（ANT）和磷酸转移酶（APH）三大类共30余种,修饰氨基糖苷类的特定功能基团，使其降低或丧失对靶位核糖体的亲和力［11，12］。AMEs基因起源于抗生素产生菌，编码产生的酶起自我保护作用，由于抗生素泛用和滥用导致耐药基因的传播，成为临床病原菌氨基糖苷类耐药重要机制。本地区医院感染阴沟肠杆菌 AMEs基因呈流行趋势，20株菌（100.0％）均检出AMEs基因，未检出aac（3）-Ⅲ和aac（3）-Ⅳ基因（详见表4），与黄支密［13］的报导存在一定差异，主要为地区差异所致。85%的菌株携带2种以上AMEs基因，其中1株菌同时检出6种AMEs基因、2株同时检出5种基因、9株同时检出3种基因、5株同时检出2种基因，以携带3种和2种修饰酶基因多见。3株菌仅1种基因阳性，分别是携带ant（3''）-Ⅰ、aac（6'）-Ⅰ和aac（3）-Ⅰ，均导致对3种氨基糖苷类抗生素的耐药。可见，虽然不同种类及亚型的AMEs作用的底物、基团及位点不同，但由于氨基糖苷类抗生素的化学结构和作用机制相似，因此1种修饰酶可导致对多种氨基糖苷类抗生素活性下降甚至失活，细菌只要获得一种（或以上）AMEs基因，即可对多种氨基糖苷类药物表现耐药。大部分菌株即使获得2个或以上个AMEs基因，但并不都对所有氨基糖苷类药物表现出较强的耐受性。本组2株菌对庆大霉素和妥布霉素耐药而对阿米卡星敏感，分别检出2种和3种AMEs基因，可能与基因的表达程度、细菌的产酶量和不同抗生素的抗菌活性及其对酶的稳定性差异所致，有待于进一步研究。可见，细菌携带多种AMEs基因并没有令细菌对氨基糖苷类药物的耐药性产生重要影响。仅1株菌检出仅携带AMEs基因，其余19的菌株同时携带AMEs和Bla基因。1株菌携带TEM、DHA和6种AMEs基因，2株菌携带TEM、DHA和5种AMEs基因，4株菌携带TEM、DHA和3种AMEs基因。因此同时携带多种耐药基因是细菌多重耐药的一种重要机制。
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作者单位：花都人民医院检验中心，广东 广州 510800； 花都区中医院,广东 广州 510800; 新华医院，广东 广州 510800.