携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛大肠杆菌的毒力基因分析

【摘要】  目的 探索HPI毒力岛阳性大肠杆菌的毒力基因存在情况。 方法 使用PCR和杂交技术对152株HPI毒力岛阳性的大肠杆菌进行相关毒力基因检测。 结果 在152株携带HPI毒力岛的大肠杆菌中，基本上未检出常见的5类致泻性大肠杆菌的毒力基因，但是部分菌株检出泌尿道致病性大肠杆菌PAI毒力岛基因yc73和prrA以及RTX毒力岛基因rtx615。 结论 这些大肠杆菌和已知的致泻性大肠杆菌有明显不同，携带HPI毒力岛的大肠杆菌可能包括几个不同的群，可能存在其它的尚未发现的毒力因子，有必要继续进行进一步研究。

【关键词】  毒力岛；致泻性大肠杆菌；毒力基因

Detection of virulence genes of Esherichia coli harboring high pathogenicity island of Yersinia enterocholitica isolated in China.
　　
　　YANG Xiao-ping, XU Jian-guo.

　　（Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, P. R. China）

　　Abstract：Objective  To investigate the existence of virulence genes of Escherichia coli （E.coli） in HPI strains positive for E.coli.  Methods  The virulence genes or putative virulence genes in 152 HPI strains positive for E.coli were detected by using PCR and/or hybridization methods.  Results  There no common virulence genes in HPI strains positive for E.coli were detected, but PAI genes of UPEC, such as yc73 and irp2, were detected in 28 of 152 （18.4%） strians, and “O” island 28 was detected in 33 of 152（21.8%） strains. Unexpectedly, 15 of 152 strains were found harboring PAI of UPEC and “O” island 28 of E.coli O157:H7 at the same time.  Conclusion  The isolates of HPI-harboring E.coli belong to several groups and there might be other virulence genes to be detected from other enteric bacterial pathogens such as Shigella, Salmonella and so on.

　　Key words：Pathogenicity island；Escherichia coli；Virulence gene

　　毒力岛是近几年细菌学领域在细菌致病机理研究中出现的一个新概念，最初由Hacker等［1］提出。到目前为止，在细菌中发现的毒力岛已达30多个,如EPEC 的LEE毒力岛；O139霍乱弧菌的otnA otnB毒力岛；幽门螺杆菌的Cag毒力岛；鼠伤寒沙门氏菌的SPI毒力岛等等［1,2］。研究表明,许多病原性细菌不仅存在毒力岛，而且同一种病原菌可以具有多个毒力岛，不同的病原菌也可具有相同的毒力岛。毒力岛在细菌致病过程中究竟发挥何等作用，在细菌进化过程中扮演何种角色，以及毒力岛以何种机制获得和转移等一系列问题尚待解决和回答。HPI毒力岛（High pathogenicity island，HPI）在鼠疫耶尔森菌属中首先发现。该岛在低毒株和无毒株中缺失，仅存于强毒株，且HPI毒力岛的缺失可导致该菌对小鼠的毒性明显下降［3］。和鼠疫耶尔森氏菌HPI毒力岛相比，小肠结肠炎耶尔森氏菌的HPI毒力岛发生了部分缺失［4,5］。小肠结肠炎耶尔森氏菌的HPI毒力岛由染色体上编码合成、运输和摄取铁载体耶尔森氏菌素（Yersinbactin,Ybt）的毒力基因簇组成，主要行使铁摄取功能［6］。程伯鲲等发现，部分从腹泻病患者粪便标本中分离到的、用常规方法不能鉴定的大肠杆菌中，可检出HPI毒力岛,检出率为27.05%（436/1612）。其中从市售食品标本中分离的大肠杆菌中，携带HPI毒力岛的大肠杆菌的检出率为10.23%（9/88）。从家畜家禽粪便中分离的携带HPI毒力岛的大肠杆菌检出率为5.71%（16/280）。携带HPI毒力岛的大肠杆菌所致腹泻的典型临床表现为食欲不振、腹痛、寒战乏力、正常体温或低热、每日腹泻多在6次以上、多为粘液便［7］。对山东省4个医院就诊的腹泻病患者粪便标本进行细菌性病原菌分析发现，携带HPI毒力岛的大肠杆菌占所有肠道病原菌的第三位，比例为6.28%（居弧菌和志贺氏菌之后）。其临床症状以低热或正常体温、黏液便、日腹泻6次以上为主要特点［8］。但是，这些携带HPI毒力岛的大肠杆菌，与致病五类大肠杆菌有明显的区别。其是否携带其他的毒力因子,我们对此进行了研究。

　　1  材料和方法

　　1.1  菌株

　　1.1.1  菌株来源  本实验所检测的大肠杆菌为1998年从山西省儿童医院、沈阳市卫生防疫站、沈阳市和平区卫生防疫站、山东省卫生防疫站、新疆维吾尔自治区卫生防疫站的腹泻病人和家畜家禽的粪便标本或食品标本中分离到的大肠杆菌。所分离的菌株经过生化反应鉴定为大肠杆菌，血清鉴定不属于ETEC、EPEC、EIEC、EHEC，但irp-2基因探针杂交阳性。本次实验所选对照菌株为本室保存菌株，见表1。

　　1.1.2  主要试剂  地高辛标记和检测试剂盒，购自德国宝灵曼公司；DNA纯化试剂盒购自美国QIAGEN公司；Taq酶购自华美生物制品公司；dNTP购自美国promega的公司。硝酸纤维素膜购自北京化工学校附属工厂。PCR扩增仪（中国科学院遗传学所），液体培养基：氯化钠10g，酵母粉5g，定容至1 000ml。往其中加入琼脂粉至终浓度1.8%，即为固体培养基。

　　表1  对照菌株的特征和来源（略）

　　1.2  PCR反应

　　1.2.1  引物设计  为便于结果比较，尽可能采用文献中设计的引物［9］；其他引物应用Oligo软件进行设计，引物均由上海生物工程公司合成。具体基因序列见表2。

　　表2  致泻性大肠杆菌毒力基因的引物（略）

　　1.2.2  扩增体系  终反应体系为50μl，具体成分如表3。

　　1.3  DNA杂交

　　1.3.1  目的片段的纯化  按照QIAGEN DNA纯化试剂盒操作进行目的片段纯化。

　　表3  PCR扩增体系（略）

　　1.3.2  探针标记  DNA标记采用地高辛标记，具体步骤为：（1）稀释模板DNA（0.5～3μg）至15μl 体积，与沸水浴中变性10min，冰中迅速冷却。（2）于冰上加入下列试剂：2μl 10×6核苷酸，2μl 10×dNTP，1μl klenow酶，混匀后瞬间离心，37℃培养20h。（3）加入2μl 0.2M EDTA终止反应。（4）加入2.5μl 4MliCL，75μl预冷冰乙醇，混匀。 -70℃放置30min。（5）13 000rpm离心15min，用70%预冷乙醇洗涤DNA。（6）自然干燥DNA，溶于50μl TE，-20℃储存备用。

　　1.3.3  杂交  （1）取适量模板点于已划好格的膜上，晾干后，紫外灯下照5～10min，然后用两张滤纸夹好，80℃烘箱中固定2h。（2）杂交前，将膜置于100ml 2×SSC中浸润3min。（3）预热DIG Easy Hb标准杂交液至68℃，将膜孵育30min。（4）煮沸5min, 变性探针后, 立即放入冰中冷却待用。（5）探针加入到已预热的标准杂交液中，混合均匀。（6）把预杂交液倒掉，加入探针，68℃温和摇动下过夜12h。（7）使用适量SSC进行清洗。（8）将膜置于20ml抗体中孵育30min。（9）于暗处，在10ml显色液中显色。

　　2  结果

　　2.1  检测结果  使用打点杂交和PCR方法，检测152株携带HPI毒力岛（即与irp2基因探针杂交）的大肠杆菌中的毒力基因的分布情况：（1）所有菌株都没有检测到st、lt、east、ipaB、eaf、espc、eae、hly、slt1以及slt2基因；（2）EaggEC探针阳性菌株数为3, 阳性率为1.9%；（3） yc73基因性菌株数为28，阳性率为18.4%；（4）prrA基因阳性菌株数为28，阳性率为18.4%；yc73和prrA 检出结果完全相同；（5）rtx615基因阳性菌株数为33株，阳性率为21.7%。见和表4。

　　2.2  相关统计结果  小肠结肠炎耶尔森氏菌HPI毒力岛irp2基因、UPEC的PAI毒力岛yc73/prrA基因和O157：H7大肠杆菌的“O”28岛的rtx615基因检出结果统计见表5。由表可以看出：三种基因同为阳性的菌株有15株，占9.9%；irp2和prrA/yc73同为阳性而rtx615阴性的菌株有13株，占8.6%；irp2和rtx615 同时阳性而prrA/yc73阴性的菌株有18株，占11.8%；irp2阳性而prrA/yc73和rtx615均为阴性的菌株有106株，占69.7%。

　　表4  152株携带HPI毒力岛的大肠杆菌毒力基因检测结果（略）

　　表5  irp2基因、yc73/prrA基因 和rtx615基因检出结果统计（略）

　　3  讨论

　　本实验室对各地送检的从腹泻病患者和动物粪便标本中分离到的用常规血清和生化方法不能鉴定的近2000株大肠杆菌进行irp2初筛，发现许多大肠杆菌都携带HPI毒力岛基因，暂称为携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛的大肠杆菌。国际上目前还没有对携带HPI毒力岛的大肠杆菌的毒力因子进行检测和较为全面的研究。研究发现，这些携带HPI毒力岛的大肠杆菌，不属于已知 ETEC、EIEC、EPEC和EHEC。在所检测的152株大肠杆菌中，有3株和EaggEC探针杂交，属于集聚性黏附大肠杆菌。结果提示，如果属于新致泻性大肠杆菌，则可能具有与已知致泻性大肠杆菌不同的毒力因子。UPEC的PAI毒力岛发现于分离自急性膀胱炎患者的CFT-073菌株。PAI毒力岛编码hlyA溶血素、pap菌毛等基因。按原定义，prrA-modD-yc73-fepC基因簇属于PAI毒力岛。分析发现，两者之间有K12序列，提示可能可以分为2个毒力岛。其中，prrA基因编码TonB依赖的外膜受体，modD基因编码钼转运蛋白，yc73编码与流感嗜血杆菌yc73蛋白相似的产物，fepC编码高铁肠杆菌素转运ATP结合蛋白。本研究中发现，在28株菌中，携带泌尿道致病性大肠杆菌与铁代谢有关的基因prrA和yc73，阳性比例可达18.4%。叶长芸［2］的研究发现，产生志贺毒素的O157：H7大肠杆菌均具有prrA基因簇，而不产生志贺毒素的O157：H7大肠杆菌都没有prrA基因簇。提示prrA基因簇可能应该属于毒力岛的范畴，可能和细菌的毒力有关。O157：H7大肠杆菌DNA序列发表后，李新军等发现，在O157：H7大肠杆菌中存在一个编码RTX毒素的毒力岛（未发表资料）。任志鸿等发现，所有检测产生志贺毒素的O157：H7大肠杆菌都具有这个毒力岛，而不产生志贺毒素的O157：H7大肠杆菌，都没有这个毒力岛。本研究使用该毒力岛的rtx615基因序列，以PCR和杂交方法进行检测。结果发现，在152株携带耶尔森菌HPI毒力岛irp2基因的大肠杆菌中，有33株rtx615阳性，阳性率为21.8%。研究还发现，一部分菌株同时携带PRRA基因和RXT毒力岛基因。如何评价部分携带HPI毒力岛的大肠杆菌同时具有PRRA和/或RXT毒力岛基因，有待进一步研究。研究提示，在这些携带HPI毒力岛的大肠杆菌中，可能存在其它尚未发现的毒力因子，有必要继续进行研究和探讨。

【参考文献】
  ［1］ 徐建国. 分子细菌学［M］.科学出版社,2000.

　　［2］ 叶长芸,徐建国. 细菌的毒力岛［J］.微生物学报,2002,29（4）:108～112.

　　［3］ Buchrieser C, Prentice M, Carniel E. The 102-kilobase unstable region of Yersinia pestis comprises a high-pathogenicity island linked to a pigmentation segment which undergoes internal rearrangement［J］. J Bacteriol, 1998, 180（9）:2321～2329.

　　［4］ Rakin A, Noelting C, Schubert S, et al. Common and specific characteristics of the high-pathogenicity island of Yersinia enterocolitica［J］. Infect Immun,1999, 67（10）:5265～5274.

　　［5］ Carniel E, Guilvout I, Prentice M. Characterization of a large chromosomal "high-pathogenicity island" in biotype 1B Yersinia enterocolitica［J］. J Bacteriol,1996,178（23）:6743～6751.

　　［6］ Pelludat C, Rakin A, Jacobi CA, et al. The yersiniabactin biosynthetic gene cluster of Yersinia enterocolitica: organization and siderophore-dependent regulation［J］. J Bacteriol, 1998,180（3）:538～546.

　　［7］ 程伯鲲, 崔树玉,温宪芹,等. 我国腹泻病患者和家畜家禽粪便标本中携帶小肠结肠炎耶尔森氏菌HPI毒力岛的大肠杆菌的初步调查［J］.中华流行病学杂志,2000,21（2）:130～133.

　　［8］ 崔树玉,温宪芹,孟蔚,等. 山东省腹泻病人携带耶尔森菌HPI毒力岛大肠杆菌的调查［J］. 中华流行病学杂志, 2001,22（1）:46～48.

　　［9］ Nataro JP, Kaper JB. Diarrheagenic Escherichia coli［J］. Clin Microbiol Rev,1998,11（1）:142～201.

作者单位：中国疾病预防控制中心, 北京 102206.