湖北省未经抗病毒治疗的HIV-1感染者的耐药基因变异分析

【摘要】  目的 了解湖北省部分地区未经抗病毒治疗的HIV感染者的耐药基因变异情况。 方法 采集HIV-1感染者抗凝全血，提取血浆病毒RNA，用巢式PCR方法（Nested polymerase chain reaction, nested-PCR）扩增HIV-1 pol区基因片段的核酸序列，并进行序列测定及耐药基因型分析。 结果 135份样本中有115份扩增出pol区基因并进行序列测定。在蛋白酶基因上检测到的基因突变有：L63ASP（99.13%）, A71TV（32.18%）, V77IM（93.04%）, I93L（90.43%），L10I（1.74%）, K20EMR（3.48%）, L24V（0.87%）, V32AE（1.74%）, M36I（2.61%）, I47M（0.87%）；逆转录酶上针对核苷类逆转录酶抑制剂的突变有：E44K（0.87%）,T215S（0.87%）；针对非核苷类逆转录酶抑制剂的突变有：K103INR（3.48%）, V106I（1.74%）, G190AR（1.74%）。显示115份样本中对NNRTIs的高度耐药突变出现2例，而针对PIs和NRTIs没有出现中度以上的耐药突变。 结论 湖北省未经抗病毒治疗的HIV感染者多数对现有的免费抗病毒药物敏感，但也发现有少数耐药基因的存在。应加强用药的科学性和抗病毒治疗用药的监管。

【关键词】  HIV-1；耐药变异；高效抗逆转录病毒治疗

Analysis of mutations of drug-resistant HIV-1 protease and reverse transcriptase genes in treatment-nave patients in Hubei Province.

　　TANG Hong, ZHAN Fa-xian, PENG Guo-ping, et al.

　　（Hubei Provincial Center for Disease Control and Prevention, Wuhan 430079, Hubei, P. R. China）

　　Abstract：Objective  To understand the mutations of drug-resistant gene in treatment-nave patients living with HIV-1 in Hubei Province.  Methods  Anticoagulated blood were collected from 135 patients living with HIV and plasma viral RNA were extracted. HIV-1 genes in pol region were amplified by nested-PCR and the sequences were analyzed for genotypic antiretroviral resistance.  Results  One hundred and fifteenth samples were amplified and sequenced. Some protease （PR） drug-resistant mutations ,such as L63ASP（99.13%）, A71TV（32.18%）, V77IM（93.04%）, I93L（90.43%），L10I（1.74%）, K20EMR（3.48%）, L24V（0.87%）, V32AE（1.74%）, M36I（2.61%）, I47M（0.87%） were determined; RT drug-resistant mutations to NRTIs, such as  E44K（0.87%）,T215S（0.87%） wer detected; Mutations to NNRTIs, such as  K103INR（3.48%）, V106I（1.74%）, G190AR（1.74%） were also detected.  High resistance to NNRTIs was identified in 2 patients, but no high and intermediate resistance to PIs or NRTIs was noticed.  Conclusion  Most of the treatment-nave patients living with HIV in Hubei Province were sensitive to the antiretroviral available drugs of free treatment regimens. But there is drug resistance-related mutations in several samples. Therefore the work of scientific monitoring and management of antiviral drug be further strengthened.

　　Key words：HIV-1;  Genotypic mutations of drug resistance; HAART

　　高效联合抗病毒治疗（HAART）是目前治疗艾滋病的最有效的方法，它能够控制患者体内的HIV病毒载量，推迟HIV感染的临床进程，有助于患者的免疫重建［1］。但是，因为HIV病毒的高变异性和治疗过程中药物的选择压力,病毒极易发生变异。HIV耐药变异的出现以及耐药株的传播，已经成为HIV治疗失败的主要原因之一［2～5］。有调查显示，我国流行的HIV毒株出现原发性耐药基因突变的比率远远小于欧美流行的毒株［6～8］，但由于感染者在治疗过程中的药物种类单一，用药不规范，依从性差等不利因素，使得在HIV治疗过程中更容易产生耐药毒株。从2003年开始国家对HIV感染者实施“四免一关怀”政策，湖北省越来越多的感染者得到了免费治疗。在更多的感染者得到治疗之前，对病毒株的耐药变异的检测和耐药毒株传播的控制显得更加重要。本文通过对湖北省部分地区的135例未经抗病毒治疗的HIV感染者进行了蛋白酶和逆转录酶的耐药基因型检测和分析，以期掌握该地区未经治疗的感染者的耐药变异发生情况，为下一步的治疗打下基础。

　　1  对象与方法

　　1.1  标本来源及处理  135例HIV感染者均由湖北省疾病预防控制中心采用免疫印迹法确证为阳性，样本来自湖北省随州市、大冶市，经问卷调查确认未接受任何抗病毒治疗。样本为2004、2005年间采集，每人采集抗凝全血10ml，24h内检测CD4细胞（BD公司FACSCalibur流式细胞仪，CD4/CD8/CD3 TRITEST试剂，采用MultiSET软件获取分析数据）。同时分离血浆用于病毒载量检测（COBAS AMPLICOR HIV-1 Monitor 1.5 Test）和耐药基因性检测。

　　1.2  核酸序列扩增及序列测定  采用Qiagen公司QIAamp Viral RNA Extraction Kit提取血浆病毒RNA。逆转录合成cDNA，引物为（RT-215’-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3’），得到的cDNA 作为nested-PCR 的模板。经巢式PCR扩增pol区基因片段。第一轮反应引物为MAW-26 （5’-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3’）。第二轮反应内侧正向引物PRO-1（5’-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3’），内侧反向引物RT-20 （5’-CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC-3’）。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳确认分子量无误后，将扩增产物纯化后送上海生工进行序列测定，测序引物为PRO-1、RTA（5’-GTTGACTCAGATTGGTTGCAC-3’）及RTB（5’-CCTAGTATAAACAATGAGACAC-3’）。

　　1.3  序列分析  BioEdit软件处理原始核苷酸序列,参照测序谱图进行基因序列修订后,利用斯坦福HIV耐药基因变异数据库（http://hivdb.stanford.edu）对所得序列进行耐药基因型的分析，对结果进行统计学处理。

　　2  结果

　　2.1  感染者临床背景信息  135份样本经测定，全部为B亚型。其中男性占65.93% （89/135）；女性占34.07% （46/135）。年龄范围26～65，平均年龄为44.5岁，97.04%的感染者为经血途径感染。CD4+T细胞计数集中在100个/mm3～399个/mm3之间，200个/mm3以上的样本数占62.22%。67.41%的样本病毒载量小于10万（表1）。

　　表1  135例感染者感染者临床和流行病学特征（略）

　　2.2  蛋白酶（PR）和逆转录酶（RT）的基因型耐药性突变  在全部的135份样本中得到pol基因测序结果的样本有115份。所有样本都检出对蛋白酶抑制剂相关的耐药基因突变位点，但除L63S（5.22%）, L63P（93.04%）, A71T（25.22%）,A71V（6.96%）, V77I（92.17%）, I93L（90.43%）之外的突变位点出现的频率都比较低（n≤3）（表2）。另外，13份样本检出对逆转录酶抑制剂的耐药基因突变。其中，NRTIs相关的突变1个：E44K（0.87%）；NNRTIs相关的突变8个：K103I（0.87%），K103N（1.74%），K103R（0.87%），V106I（1.74%），G190A（0.87%），G190R（0.87%），没有发现出现比较集中的耐药基因突变。

　　表2  蛋白酶、逆转录酶基因上出现的耐药突变（n=115）（略）

　　2.3  耐药性基因突变位点对抗病毒药物敏感性的评价  按照斯坦福大学建立的HIV耐药基因突变的评价表，对出现的各个耐药突变的耐药情况进行评价（表3）。可以看到，蛋白酶基因上的突变除K20M能引起APV和LPV的低度耐药突变外，均未能达到低度耐药的水平, 在有其他主要耐药突变出现的情况下，L63位，A71位，V77位，I93位的突变对病毒的耐药性有一定的影响，但单独存在不会产生耐药性；逆转录酶基因上的突变K103N引起对三种NNRTIs（NVP，DLV，EFV）的高度耐药，K103I则引起这三种药物的低度耐药，而G190A引起NVP的高度耐药和EFV的中度耐药，G190R引起这两种药物的低度耐药。因此，在135份样本中，有1份出现针对PIs的低度耐药，1份针对NRTIs的低度耐药突变，2份出现对NNRTIs的高度耐药突变，另外还有2份出现对NNRTIs的低于中度水平的耐药基因突变。

　　表3  蛋白酶、逆转录酶基因耐药突变引起对抗病毒药物敏感性变化（略）

　　注：P指潜在耐药; L指低度耐药; I指中度耐药; H指高度耐药。

　　3  讨论

　　HIV感染宿主后，以107～108次/d的速度进行着病毒的复制。同时，由于HIV逆转录酶缺乏校读功能,造成复制产物中存在着碱基错配，从而使得病毒变异性很高［9］。而病毒基因的高度变异性和耐药性毒株的传播,使得未经抗病毒治疗的艾滋病患者也可能存在耐药性突变。我们研究的135位感染者平均年龄在44.5岁，绝大多数为青壮年。CD4+T淋巴细胞计数在200个/mm3以上的样本数占62.22%，67.41%的样本病毒载量小于10万，尚未达到治疗标准。从测序结果中看到，蛋白酶基因上L63位，A71位，V77位，I93位突变发生的频率极高，这与之前的调查结果基本一致（L63P, 88.41%; V77I,3，4.15%; I93L, 95.73%）［6］。然而无论蛋白酶还是逆转录酶基因上都未发现有出现非常集中的耐药基因突变，考虑到所有感染者均是在上世纪90年代中期感染，因此他们通过用药人群传播获得耐药突变的机率很小，更可能是病毒自身在复制过程中产生的原发性突变。在得到的115份序列中我们发现了1份对种蛋白酶抑制剂（APV和LPV，突变的比率为0.87%）,4份对8种逆转录酶抑制剂（突变的比率为3.48%）分别存在不同程度的耐药性，但出现中度以上的耐药的样本只有2份（1.74%）。说明在湖北省的这些地区，原发性耐药基因突变的比率仍然较低，除个别患者外，对于免费治疗中的药物敏感。但是，仍然存在对主要抗病毒药物具有高度耐药性的病例，并且有潜在的耐药基因突变的发生，因此抗病毒治疗必须严格遵守服药程序、保持良好的服药依从性以及定时进行检测，否则仍会导致耐药性毒株的出现和传播。

　　致谢:中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心、上海疾病预防控制中心艾滋病预防控制中心、湖北省随州市及大冶市疾病预防控制中心

【参考文献】
  ［1］ Li Ts,Tubiana R,Katlama C,et al. Long-lasting recovery in CD4 T cell function and viral-load reduction after highly active antiretroviral therapy in advanced HIV-1 disease［J］. Lancet,1998,351:1682～1686.

　　［2］ Gallant JE,Gerondelis PZ,Wainberg MA,et al. Nucleoside and nucleotide analogue reverse transcriptase inhibitors : a clinical review of antiretroviral resistance［J］. Antivir Ther,2003,8:4892～5061.

　　［3］ Cingolani A,Antinori A,Rizzo MG,et al. Usefulness of monitoring HIV drug resistance and adherence in individuals failing highly active antiretroviral therapy: a randomized study （ARGENTA）［J］. AIDS,2002,16:3692～3791.

　　［4］ Sarmati L,Nicastri E,Uccella I,et al. Drug-associated resistance mutations in plasma and peripheral blood mononuclear cells of human immunodeficiency virus type 1-infected patients for whom highly active antiretroviral therapy is failing［J］. J Clin Microbiol,2003,41:17602～17621.

　　［5］ Blaise P, Clevenbergh P,Vaira D,et al. HIV resistance to antiretroviral drugs: mechanisms,genotypic and phenotypic resistance testing in clinical practice［J］. Acta Clin Belg,2002,57:1912～2011.

　　［6］ 司雪峰，黄海龙，魏民,等.我国HIV-1感染者耐药突变的流行性研究［J］.中华实验和临床病毒学杂志,2002, 18（4）:308～311.

　　［7］ Little SJ, Holte S,Routy JP,et al. Antiretroviral-drug resistance among patients recently infected with HIV［J］. N Engl J Med, 2002,347:385～394.

　　［8］ UK Collaborative Group on Monitoring the Transmission of HIV Drug Resistance. Analysis of prevalence of HIV-1 drug resistance in primary infections in the United Kingdom［J］. BMJ, 2001, 322:1087～1088.

　　［9］ Little SJ . Transmission and prevalence of HIV resistance among treatment-naive subjects［J］. Antiviral Therapy,2000,5:33～40.

作者单位：湖北省全球基金艾滋病项目资助（协议号：GF06003） 湖北省疾病预防控制中心,湖北 武汉 430079.