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【摘要】 目的 探讨ELISA检测法检测食品中氯霉素的可行性。 方法 采用国际上先进的ELISA 检测法和酶标读数仪定量检测，并与高效液相色谱—电喷雾串联质谱法(HPLC-MS/MS)比较。 结果 氯霉素含量为0.05～0.20μg/kg之间，CV%为2.5%～5%，回收率为85.0%～110.0%，标准曲线r=-0.992～-0.999。 结论 ELISA法具有灵敏度高，干扰少，测定步骤简便、快速。操作安全，设备投资少，测定结果准确可靠。
【关键词】 氯霉素 食品 ELISA检测
Application of ELISA in determination of chloramphenicol in foods.
LIU Qi-fang.
(Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shenzhen 518020, Guangdong, P. R. China)
Abstract：Objective To explore the feasibility of determination of chloramphenicol in the foods by ELISA. Methods Quantitative determination was carried out with ELISA and stat fax 303 readout. Results The contents of chloramphecnicol were in the range of (0.05～2.0)g/kg,CV was in the range of 2.5%～5%, the recovery rate was from 85.0% to 110.0% and the standard curve r was between -0.992 and -0.999. Conclusion This method is simple,sensitive and rapid with little interference. The determination result is accurate and reliable.
Key words：Chloramphecnicol; Food; ELISA
氯霉素又称氯胺苯醇，略称CAP，是一种抗菌和抗立克次体药。氯霉素类药物是一类广谱抗生素,主要包括氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)和氟苯尼考(FF),兽医临床上用于治疗畜禽的细菌性疾病。食品中CAP残留对人类的健康构成直接或潜在的威胁,特别是氯霉素导致人类再生障碍性贫血，这种非剂量依赖的毒性特点,与剂量和疗程无关,引起国际组织和许多国家、地区的特别重视,并严格禁止在食品动物饲养过程中使用,同时实施愈来愈严格的计划监控,1994年欧盟、美国等国在相关食品卫生法规中规定氯霉素残留的限量标准为“零容许量",即不得检出。氯霉素的残留成为国际贸易中的技术壁垒,检出限的要求越来越严格,欧盟由原来的10μg/kg降至0.1μg/kg,比原来的标准要求提高了100倍;因此,寻求快速、灵敏检测技术、降低方法的检出限成为氯霉素残留检测技术研究焦点［1～6］。氯霉素筛查和定量酶联免疫检测方法,是利用竞争性酶联免疫检测技术，筛查各种基质中存在的氯霉素和氯霉素－葡糖苷酸（尿样中代谢物）。可用于尿样、牛奶、蛋类和组织样品（包括虾、蟹和鱼类）中氯霉素的检测。
1 材料与方法
1.1 原理 根据微滴酶联免疫原理设计，微孔板包被有绵羊抗兔IGg的固定抗体，加入特异抗体（兔抗CAP）、酶标记CAP(酶结合物)、CAP标准品或样品后。温育过程中，特异性抗体与固定抗体结合，同时游离CAP(存在于标准溶液或样品中)和酶结合CAP，相互竞争与特异性抗体的结合位点结合（即竞争性酶免检测）。然后在洗涤步骤中除去未结合的酶标记试剂。加入色原底物（四甲基联苯胺），结合的酶结合物将无色的色原转化为蓝色的产物。加入终止液终止反应，颜色由蓝色变黄，在450nm波长下检测吸光光度值，吸光值与样品中的氯霉素浓度成反比。
1.2 方法
1.2.1 试剂与仪器 EURO-DIAGNOSTICA Fast (荷兰ED公司) 0.025～2.0μg/kg氯霉素检测试剂盒。Start Fax 303 Plus Microstrip Reader 液晶显示酶标仪。
1.2.2 牛奶样品处理 直接法:样品在4℃下2 000g离心15min，撇去上层脂肪，取50μl用于检测。对于酸奶样品，应将pH值调节至中性再进行检测；抽提法：取5ml牛奶样品，在0～4℃, 2 000g离心15min，撇去上层脂肪，转移2.5ml脱脂奶到玻管与5ml乙酸乙酯混合，涡旋1min，静置5～10min令其发生相分离,转移4ml乙酸乙酯上层到干净玻璃管中，50℃温和氮流蒸发乙酸乙酯，残留物溶解于200μl稀释缓冲液（2ml牛奶/200μl缓冲液），取50μl用于检测。脱脂奶粉处理方法：将60ml蒸馏水加入10g脱脂奶粉，再按上述步骤操作。
1.2.3 蛋类样品处理 取1g匀浆全蛋（蛋白或蛋黄）与6ml乙酸乙酯涡旋混合1min(如果振荡过度会变成果冻状)，2 000g离心10min，将3ml上层乙酸乙酯转移到玻管中，50℃温和氮流蒸发乙酸乙酯，残留物溶于1ml异辛烷/三氯甲烷（2：3，v/v），并加入0.5ml稀释缓冲液，上述物质涡旋混合1min，2 000g离心10min，取50μl上层（1g全蛋，蛋白或蛋黄/m）用于检测。
1.2.4 组织样品处理（肉类、肝脏、虾类、蟹类、鱼类） 方法1：10g去除脂肪的样品匀浆化，3g匀浆化样品与6ml乙酸乙酯混合10min，2 000g离心10min,转移4ml乙酸乙酯上层到干净玻璃管，50℃温和氮流蒸发乙酸乙酯， 脂肪残留物溶于1ml异辛烷/三氯甲烷（2：3 V/V），并加入1ml稀释缓冲液，涡旋混合1min，2 000g离心分离10min。 吸取50μl上层用于检测。方法2：用于虾、鱼、蟹类的大样品处理10g匀浆化样品与20ml乙酸乙酯混合10min，离心分离（10min和2 000g）或用滤纸过滤，将10ml乙酸乙酯层转移入清洁玻管，用温和的氮流蒸发掉乙酸乙酯，残留物溶于2ml异辛烷/三氯甲烷（2：3V/V）并加入1ml稀释缓冲液，充分混合。若发现乳化，可将试管在水浴（80℃）中加热（5min）。并将此溶液在2 000g下离心10min。利用巴斯德滴管转移上层清液（若用正已烷，清液则在下层）于清洁玻璃管中。再加入1ml异辛烷/三氯甲烷（2：3 V/V）。混合上述溶液并离心分离如上。吸取50μl上层用于检测（若用正已烷，清液则在下层）。
1.2.5 蜂产品处理 3g蜂蜜样品与3ml蒸馏水充分混合，加入6ml乙酸乙酯充分振荡混合10min, 2 000g离心10min，转移4ml上层乙酸乙酯到干净玻璃管，50℃温和氮流下蒸发掉乙酸乙酯,残留物充分溶解于1ml样品稀释缓冲液，吸取50μl用于检测。对于不纯净的蜂蜜应进行脱脂处理：将氮流蒸发后的残留物溶于1ml异辛烷/三氯甲烷（2：3V/V），加入1ml样品稀释缓冲液，涡旋混合1 min，2 000g离心分离10min，吸取50μl上层（1g蜂蜜/ml），用于检测。
1.2.6 检测步骤（室温20～25℃下操作最佳） 将所需数量的孔条插入微孔架，记录孔位置，标准和样品做双孔平行实验。滴加100μl重组/零标标准缓冲液于孔A1、A2,滴加50μl重组/零标准缓冲液于孔B1、B2,滴加50μl各标准稀释液于孔C1，2-HI，2,滴加50μl各样品溶液于其余的微孔中,滴加25μl结合物溶液（CAP-HPRO） 于除A1和A2外的全部板孔,滴加25μl抗体溶液（Anti-CAP）于除A1和A2外的全部板孔,封板，摇板1min,4℃下在暗处温育1h后用洗涤缓（270μl）注入全部板孔，再次倒掉微孔中液体。重复上述操作3遍。如使用自动扳机，可预定洗板完成5次周期。将100μl底物溶液加入各孔。室温（25℃）暗处温育30min,将100μl终止液加入各孔, 以450nm为吸收波长，630nm为参比波长。先输入6标准浓度值（0.025，0.050，0.10，0.20，0.50，2.0μg/kg），制标准曲线。接着测定样品孔，得出每孔样品测定值μg/kg。
1.2.7 注意事项 操作之前将所有试剂回升至室温20～25℃；使用完后立即将所有试剂放回2～8℃；在使用中不要让微孔干燥，在酶联免疫测定中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，严格按照测定程序中的要求操作；在所有恒温孵育过程中，避免光线照射。
2 结果
2.1 样品氯霉素含量计算 样品氯霉素含量(μg/kg)=仪器读数×稀释倍数。
2.2 再现性 将获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应氯霉素浓度作曲线，可以看到在全部范围的变异系数很低，可以得到很好的再现性，见图1。
图1 氯霉素含量0.05～2.0μg/kg之间的再现性范围（略）
2.3 回收率 以鲜猪肉样品为例，回收率为85.0%～110.0.0%，见表1。
表1 回收实验结果（略）
2.4 标准曲线r= -0.999
图2 氯霉素标准曲线（略）
2.5 干扰试验 探索该实验方法的特异性反应情况，通过加入不同浓度的各种抗生素，进行干扰试验，评估该方法特异性反应情况。见表2。
表2 加入几种抗生素的干扰试验（略）
2.6 稳定性 同一标准曲线在不同的时间进行测定，每隔10d重复测定1次，总共测定10次，在90d内，标准曲线的相关系数r值为-0.992～-0.999。
2.7 对照实验 同时采用该方法与高效液相色谱—电喷雾串联质谱法（HPLC-MS/MS）进行双盲测验，对25份样品进行测定，20份阴性样品和5份阳性样品测定结果符合率达100%。
3 讨论
酶联免疫方法结合了色谱技术，采用氯霉素的特异性抗体，以不高的技术要求和更短的检测时间获取了更高的精确度和更灵敏的反应结果。在氯霉素含量为0.05～0.2μg/kg之间，CV为2.5%～5%，回收85.0%～110.0%,同一份标准曲线在不同时间测定（间隔10d）连续测定10次，r值在-0.992～-0.999之间，表明该方法稳定性好。用6种常见的抗生素呋喃唑酮、链霉素、庆大霉素、青霉素、四环素、新霉素分别进行干扰试验，试验结果表明该方法特异性很好，不受其它抗菌素的干扰。同时采用该方法、高效液相色谱—电喷雾串联质谱法（HPLC-MS/MS）进行双盲测验，对25份样品进行测定，20份阴性样品和5份阳性样品测定结果符合率达100%。该方法适用于奶样、虾、肉类、肝脏、鱼、蛋食品氯霉素的测定，达到了国际上检测食品中氯霉素的先进技术。是目前国际上测定食品中氯霉素较好的方法。
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作者单位：深圳市疾病预防控制中心，广东 深圳 518020.