耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因多态性分型研究

【摘要】  　　目的 研究耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的基因多态性分型特征，为控制感染提供分子流行病学依据。 方法 利用一条10bp 随机引物，建立随机引物多态性（RAPD）分析方法，并利用这一方法对44 株MRSA进行基因分型的研究。 结果 44 株MRSA中有30株产生RAPD指纹图谱，经电泳得到2～8条片段，可分为5个型，其中Ⅲ型菌株占50%。 结论 通过RAPD分型研究，可了解MRSA的基因型流行特征，为控制感染提供分子流行病学依据。

【关键词】  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 随机扩增多态DNA 基因型 流行病学

　　Differentiation study on the genetic polymorphism of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus.

　　CUI Ying-peng， XU Hong-xu，TANG Lei, et al.

　　（Department of Clinical Laboratory, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510080; First Affiliated Hospital of Guangzhou Traditonal Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong, P.R. China）
   
　　Abstract：Objective  To conduct the study on the analysis of genetic polymorphic of Methicillin-resistant Staphylococcus (MRSA) and provide molecular epidemiological evidence for controlling MRSA infection.  Methods  By using short single oligomer primer of 10 bases sequences in polymerase chain reaction, randomly amplified polymorphic DNA(RAPD) was used to analyze MRSA which were previously isolated from the samples of infected patients in the 1st Hospital of Sun Yat-sen University.  Results  There 44 stains of MRSA produced 30 fingerprints, which could be observed in agarose gel and classified into 8 genotypes. Among which type Ⅲ occupied 50%.  Conclusion  RAPD results reveals the special epidemic genotypes of MRSA in the 1st Hospital of Sun Yat-sen University and this study can provide molecular epidemiological evidence for control of  MRSA infection.
   
　　Key words：Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; Random amplified polymorphic DNA; Genotyping; Epidemiology

　　耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是引起医院感染的重要病原菌，它可引起脓毒症等严重的感染，病死率高达63.6%［1］。传统细菌鉴定及分型方法不能进行基因分型，尤其在进行流行病学调查和溯源分析时，很难满足准确、快速的需要。而分子生物学技术为细菌的基因分型提供了有效手段。目前主要有脉冲场凝胶电泳分型、核糖体基因分型、随机扩增多态性分析、扩增片段长度多态性分析等［2～4］用于细菌基因分型的研究。RAPD技术利用随机引物，在一定的反应条件下扩增产生特定的DNA条带，因其简便、快速被广泛应用于医院感染的病原菌流行病学调查研究［5］。本研究对本院临床分离的部分MRSA进行RAPD基因分型研究，以探讨其在流行病学的意义，并为进一步采取感控措施提供有效依据。

　　1  材料和方法

　　1.1  菌株来源  44株MRSA为2006年6月～12月中山大学附属第一医院住院患者的痰、胆汁、分泌物、引流液、脓液、胸水、腹水、穿刺液等标本,不收集重复分离株，置-80℃保存。

　　1.2  MRSA分型与鉴定  MRSA的分型与鉴定按照《全国临床检验操作规程》（第2版）进行，细菌鉴定和药敏系统实验使用Vitek-2全自动细菌鉴定仪。

　　1.3  仪器  Vitek-2鉴定仪为法国梅里埃公司产品；GeneGenius 凝胶成像系统为英国Syngene公司产品；DU 800核酸蛋白分析仪为美国BECKMAN COULTER公司产品；PE-9700基因扩增仪为美国ABI公司产品；Microfuge-18高速台式离心机为美国BECKMAN COULTER公司产品；SubCell GT水平电泳系统为美国BIO-RAD公司产品。

　　1.4  试剂  UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(SK-1201)为上海生工产品；Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture为Fermentas公司产品；GoldviewTM核酸染料购自北京赛百盛基因技术有限公司；DNA Marker DL2,000、10×Loading Buffer为TaKaRa公司产品。

　　1.5  PCR扩增引物  RADP技术的引物为一条10bp的随机引物：5`-AGCGGGCCAA-3`，由上海生工合成。

　　1.6  DNA模板提取

　　1.6.1  取复苏后生长良好的MRSA新鲜培养物转种植于LB液体培养基，37℃ 230rpm摇菌过夜。

　　1.6.2  严格按要求用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒照说明书的要求提取DNA模板，-20℃保存备用。

　　1.7  RAPD扩增反应  反应总体系为25μl，体系中含10×PCR缓冲液2.5μl、引物2.0μmol/L、MgCl2 2mmol/L、dNTP Mixture 160μmol/L、Taq DNA聚合酶2.5U，DNA模板5μl，超纯水补足25μl。PCR循环参数：94℃预变性3min，94℃ 1min、40℃ 1min、72℃ 2min循环40次，72℃延伸7min，取10μl DNA Marker DL2,000及20μl扩增产物分别加于1.8％琼脂糖凝胶中(内含5μl GoldviewTM核酸染料)电泳，200V电泳5min，5V/cm电泳1h后进行凝胶成像。

　　2  结果

　　2.1  RAPD-DNA电泳结果  经RAPD扩增后， 44株MRSA中的7、11、27、31-36、39-43未能分型，其余30株都产生了指纹图谱，扩增产物有2～8条电泳条带；所获得的片段分子量大小均大于100bp，图1为1～14号标本的分型结果。

　　图1  MRSA菌株RAPD指纹图（略）

　　注:M为DL2,000DNA Marker;  1～14为MRSA菌株号;  BP为分子量标准

　　2.2  RAPD分型  根据条带的多少及相似性对30株MRSA进行分型，同源性较高的可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5个型。13、22、25号标本因同源性较低未能分型，见表1。

　　3  讨论
   
　　RAPD分型法为一项DNA多态性检测技术，其特点是不需预先知道有关基因序列，只需采用随机引物，通过DNA扩增，产生基因组指纹图谱进行细菌分型。该技术易于掌握，且有普遍实用性，在建立后短短几年内，在流行病学研究领域得到广泛应用。RAPD的随机性主要取决于选择引物的随机性，除随机引物的选择外待测菌的DNA模板质量［6］对RAPD的成功与否也很重要，此外RAPD指纹图条带的数目、强度还与PCR反应体系中浓度［6,7］、Mg2+和dNTP的浓度［8］、Taq DNA聚合酶的用量与纯度、PCR的循环条件［9］等密切相关，因此应优化反应条件，力求获得明显且清晰易辨的条带，并减少非特异性扩增。
   
　　本次实验的RAPD分型结果进行分析，产生RAPD指纹图谱的30株MRSA中，以MRSAⅢ型最多，占50.0%（15/30），其次为Ⅰ型、Ⅱ型，而 Ⅳ、Ⅴ型最少，分布也较为分散；从电泳指纹图结果看，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型菌株大多数都含有250、750、1000bp 3条条带，RAPD-DNA电泳带谱类似，这说明临床分离的MRSA遗传上较相近，基因同源性比较高。从MRSA分布的病区来分析，这30株MRSA主要分布在胃肠胰外科、肝胆外科、器官移植病区、SICU和神经科ICU，其它科分离的菌株量较少，基因型也较分散。除器官移植病区外，其余四个病区都以Ⅲ型为主，这种基因型克隆株特殊流行方式都提示本院MRSA具有特殊的区域性分布及RAPD基因型流行方式，其传播方式有待于进一步研究。
   
　　表1  30株MRSA的RAPD基因型分布（略）

　　注:“-”表示产生RAPD指纹图谱，但同源性较低，未能进行RAPD分型。
   
　　本研究采用RAPD方法探讨了本院MRSA致病分离株进行基因型分型的可行性，结果表明，在严格控制实验条件下，可以方便、快速得到MRSA的基因分型结果，在MRSA所致感染性疾病的调查和溯源过程中，可作为非常有力的实验证据。此方法适合在医院感染控制中的应用，其不仅可以了解医院感染的分子流行病学的趋势，同时可对医院感染趋势做出较准确的评估，为感染控制提供可靠的数据。

【参考文献】
  　　［1］ Klinika Chorob Zakaznych AM w Lodzi. Etiology and course of sepsis in adult patients treated in the Department of Infectious Diseases， Medical University of Lodz. Two-year observation［J］. Przegl Epidemio1，2001，55 Suppl 3：34～37．

　　［2］ Kluytmans J，Berg H，Steegh P，et al. Outbreak of staphylococcus schleiferi wound infections：strain characterization by randomly amplified polymorphic DNA analysis，PCR ribotyping，and pulsed- field gel electrophoresis［J］. J Clin Microbiol，1998，36（8）：2214～2219.

　　［3］ Tambic A，Power EG，Talsania H，et al. Analysis of an outbreak of non-phage-typeable meth- icillin-resistant Staphylococcus aureus by using a randomly amplified polymorphic DNA［J］. J Clin Microbiol，1997，35（12）：3092～3097.

　　［4］ Martin MC，Fueyo JM，Gonzalez Hevia MA，et al. Genetic procedures for identification of enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus from three food poisoning outbreaks［J］. Int J Food Microbiol，2004，94（3）：279～286.

　　［5］ 韦莉萍，朱冰，胡琼，等. 金黄色葡萄球菌随机扩增DNA多态性的分型研究［J］.中华检验医学杂志，2000，23（2）：111.
　　
　　［6］ SMITH J J，SCOTTCRAIG J S，LEADBETTER J R，et al．Characterization of random amplified polymorphic DNA products from Xanthomonas campestris and some comments on the use of RAPD products in phylogenetic analysis［J］．Mol Phylogenet Evol，1994，3（2）：135～145.

　　［7］ 汪永庆，徐来祥，张知彬．RAPD技术的标准化问题［J］．动物学杂志，2000，35（4）：57～59．

　　［8］ 任瑞文，卢强，徐晓立．提高RAPD稳定性的几点经验与探讨［J］．生物技术，2001，11（2）：40～41．

　　［9］ WILLIAMS J G K,DUBELIK A R，LIVAK K J，et al．DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］．Nucleic Acids Res，1990，18（22）：6531～6535．

作者单位：中山大学附属第一医院检验科，广东 广州 510080； 广州中医药大学附属第一医院检验科，广东 广州 510000.