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【摘要】 目的 研究TNF-α在急性坏死性胰腺炎(Acute necrotizing pancreatitis, ANP)大鼠肺脏的变化和意义及地塞米松的干预作用。 方法 30只Wister大鼠随机分为ANP组、假手术组(SO组)、地塞米松处理组(DXM组)，采用Western blot法检测肺脏TNF-α蛋白的表达，并测定PaO2、肺湿/干重（W/D）、血清淀粉酶(AMS)及血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6（ IL-6）水平；光镜下观察胰腺及肺脏病理改变。 结果 ANP组PaO2下降，W/D、AMS及血清TNF-α、IL-6明显升高，肺脏TNF-α蛋白表达上调，光镜下胰腺和肺脏明显损伤，地塞米松组TNF-α蛋白在肺脏的表达和IL-6的产生以及组织的损伤程度均低于其他组，而PaO2高于其他组。 结论 TNF-α参与了大鼠ANP时肺组织的损伤，地塞米松对ANP时肺组织损伤有保护作用，下调的TNF-α可能参与其保护作用。
【关键词】 大鼠 急性坏死性胰腺炎 肺损伤 肿瘤坏死因子 地塞米松
Study on intrapulmonary expression of TNF-α and effects of dexamethasone in rats with acute necrotizing pancreatitis.
ZHAO Guang-rong, LEI Ming-sheng, GAO Xu-zhao.
(Department of Gastroenterology, The First People’s Hospital of Zhangjiajie, Zhangjiajie 427000, Hunan, P.R. China)
Abstract：Objective To observe the changes in dynamic expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α) and the role of Dexamethasone in Rats with Acute Necrotizing Pancreatitis (ANP). Methods Thirty Wister rats were randomly divided into three groups:①ANP group(SO); ②Sham operation group(SO); and ③Group of acute necrotizing pancreatitis treated with dexamethasone(DXM).The TNF-αexpression of lung was detected by Western blot, whereas the PaO2，Lung Wight（W/D, wet/dry）, serum amylase(AMS) activity, serum levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α) and inter-leukin-6(IL-6) were also estimated. Meanwhile, the pathological changes of pancreas and lungs were examined under light microscope. Results In the ANP group, the levels of PaO2 decrease and the levels of W/D、 AMS、TNF-α、IL-6, displayed an increasing tendency obviously.The injury of pancreas and lung can be found under light microscope. While in DXM group, the serum levels of TNF-α and IL-6 were significantly lower than those in ANP group (P<0.05).The levels of PaO2 were higher and The levels of W/D, AMS were lower than ANP group. The lung pathological changes were also obviously alleviated in DXM group. Conclusion TNF-α is involved in the inflammation response of rat ANP and is specifically related with lung injury. Dexamethasone could effectively inhibit the expression of TNF-α, alleviate lung injury.
Key words：Rat; Acute necrotizing pancreatitis; Injury of lungs; TNF-α; Dexamethasone
急性坏死性胰腺炎(Acute necrotizing pancreatitis, ANP)是临床上常见的急症之一，病情凶险、发展迅速、预后差、病死率高，早期容易并发多脏器功能衰竭，尤其是急性肺损伤(Acute lung injury, ALI)，进一步发展即为急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)［1］，早期预防和治疗ALI对降低ANP的病死率及改善预后具有重要意义。ANP并发ALI发病机制尚不清楚，地塞米松作为抢救ARDS常用药物，具有抗炎、抗毒、抗休克、抗免疫等作用，可降低ANP的病死率。本研究用大鼠胰胆管注射牛磺胆酸钠诱发的急性坏死性胰腺炎并发肺损伤模型，观察TNF-α、IL-6在血清和肺脏的变化探讨ANP并发肺损伤的机制，观察地塞米松在ANP时的作用和可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料 200～250g健康雄性Wistar大鼠，清洁级，购自中南大学实验动物中心；牛磺胆酸钠、戊巴比妥钠(Sigma公司)；TNF-a, IL-6放免检测试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免所)；兔抗大鼠TNF-α单克隆一抗，lgG辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（Santa cruz, 购自北京中山生物技术有限公司），硝酸纤维素膜（NC膜、上海生工），Super超敏ECL发光液（普利莱基因技术有限公司）。
1.2 实验动物分组与模型复制 30只大鼠适应性饲养3～5d，术前12h禁食、自由饮水。随机分成3组：急性坏死性胰腺炎模型组(ANP, n=10），假手术组(SO, n=10)和地塞米松组(DXM, n=10)。 (1)ANP组：腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg麻醉，腹正中切口，进入腹腔，找到胆总管及胰管，胰管末端逆行穿刺插管，近肝门及十二指肠乳头处夹闭胰管两端以1 ml/kg体重胰管内注入5%牛磺胆酸钠(0.1ml/min速度逆行匀速注入)制作模型。(2)S0组：手术操作方法同ANP组，但用等剂量的生理盐水取代牛磺胆酸钠注入胆管。(3)DXM组：在ANP制模成功后15min经尾静脉注入地塞米松注射液，按照0.5mg/100g体重一次性给药。ANP和DXM组于术后15min经尾静脉注射等体积生理盐水。三组动物均于术毕皮下注射生理盐水2ml，以补充术中丢失水分，制模后6h处死；经下腔静脉采血5ml，离心(3 000r/min, 3min)，取上清-20℃冻存备测。左肺取出一部分10%甲醛固定，行组织学观察，其余部分立即冻存于液氮中，后于-70℃冰箱中保存；取右肺测定肺湿重/干重比。
1.3 PaO2及肺湿/干重（W/D）的检测 取主动脉血ABL-4血气分析仪(丹麦)测定PaO2；右肺称重后置于200℃烘干箱内烘干96h至恒重，称重并计算W/D。
1.4 血清淀粉酶(AMS)测定 HITACHI 7170全自动生化分析仪检测。
1.5 血清TNF-α、IL-6检测 采用ELISA方法，严格按照试剂盒说明书。
1.6 肺脏、胰腺的病理学检查 常规固定、包埋、切片、HE染色，光学显微镜(Olympus, Japan)下观察。
1.7 肺脏的TNF-α蛋白的表达 蛋白质印迹法（Western blot，WB）检测。具体方法：①取100g肺组织电动匀浆机匀浆，12 000r/min离心5min后取上清。以牛血清白蛋白为标准蛋白，用Lowry法测定蛋白浓度，样品分装-70℃保存。②15%SDS-PAGE分离蛋白，根据各样品蛋白浓度计算上样体积上样，80V、2～3h电泳，将蛋白电转移(185mA,3h)至硝酸纤维膜，NC膜用丽春红染色20min后用蒸馏水冲洗干净，用5%脱脂奶粉/PBS进行非特异封闭2h，0.5%Tween PBS冲洗充分后，加入TNF-α单克隆一抗，4℃孵育10～14h，0.5%Tween PBS冲洗数次，加入1:1500辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2h，再次冲洗充分后加入化学发光剂显影，进行曝光，用X线片记录影像，实验重复10次。凝胶成像系统进行分析。
1.8 统计学处理 所有数据以均数±标准差(x±s)表示，用SPSS11.0统计软件对数据进行处理，检验水准ɑ＝0.05。
2 结果
2.1 PaO2及W/D变化 ANP组和DXM组PaO2均较SO组下降（P<0.01），且ANP组PaO2低于DXM组（P<0.01），ANP组和DXM组的W/D与SO组比较有所升高（P<0.01），W/D在DXM组较ANP组降低（P<0.01），见表1。
2.2 血清淀粉酶变化 ANP组和DXM组的AMS较SO组明显升高（P<0.01），DXM组较ANP组的AMS有所降低（P<0.01），见表1。
2.3 血清TNF-α、IL-6的变化 ANP组的TNF-α、IL-6水平均较SO组明显升高（P<0.01）；DXM组的TNF-α较SO组升高（P<0.01），而较ANP组降低（P<0.01），DXM组的IL-6较ANP组低（P<0.01），而与SO组无统计学差异（P＞0.05），见表1。
2.4 肺脏和胰腺形态学改变
2.4.1 肺脏 SO组的肺脏色泽、形态正常，表面无出血点,胸腔内无渗液，光镜下肺组织结构基本正常，无炎细胞浸润。ANP组的肺叶充血水肿，肺脏表面有块状紫红色斑块，并出现血性胸腔内渗出液。光镜下肺间质及肺泡腔水肿，肺泡壁间质增宽，大量炎性细胞浸润，肺泡壁毛细血管扩张、淤血，肺泡间隔增宽，局部支气管粘膜上皮细胞胞质透亮。DXM组肺叶表面无明显的出血点，胸腔内无明显渗出液，镜下间质及肺泡腔水肿较ANP组减轻，偶见少量炎性细胞浸润。
2.4.2 胰腺 SO组胰腺浅黄色, 胰腺、胰周脂肪、网膜未见异常；光镜结构正常，轮廓清晰，未见中性粒细胞浸润,腺泡细胞和脂肪坏死、出血。ANP组胰腺体尾略大，腹腔可见血型积液，胰腺周围大网膜及腹膜可见较多皂化斑，胰腺呈胶冻状，轮廓消失，光镜下可见胰腺间质水肿、出血，可见灶状或是片状坏死、出血，周围有大量炎性细胞浸润。DXM组，腹腔积液量与皂化斑点分布面积较ANP组程度轻，间质水肿程度变轻，炎性细胞浸润较ANP组减少，可见小灶性出血、坏死。
2.5 TNF-α蛋白在肺脏的表达 SO组肺脏TNF-α蛋白为100.00±8.16，急性坏死性胰腺炎造模后6h, TNF-α蛋白在肺脏的表达上升至205.41±19.65，差异有统计学意义（P<0.01）。应用地塞米松后，TNF-α蛋白表达降低至139.78±16.27（P<0.01），但较S0组升高（P<0.01）。见表1，见图1。
表1 PaO2、肺湿/干重（W/D）、血清的AMS、IL-6、TNF-α水平和TNF-α蛋白在肺组织表达的变化（略）
注：与SO组比较，△P<0.01；与ANP组比较，▲P<0.01。
图1 TNF-α蛋白在ANP大鼠肺组织表达变化（略）
3 讨论
逆行胆管注射牛磺胆酸钠能诱导大鼠制成重症急性胰腺炎模型，升高的血清淀粉酶及胰腺的大体和光镜下的形态学改变均是急性坏死性出血性胰腺炎的表现，ANP模型复制成功。ANP 时，异常激活的胰酶在引起胰腺自身损伤的同时，激活单核巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等细胞等，合成并释放多种炎症介质, 其协同作用，板机样触发瀑布样级联反应, 发展为全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory re-sponse syndrome, SIRS)，最终导致多器官功能衰竭(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)［2］。肺脏由于自身结构和血液循环特点是最早最易受累的胰外器官。ALI和ARDS是ANP最常见和最严重的全身并发症之一，也是患者早期死亡的主要原因。本研究发现PaO2明显降低，肺叶充血水肿，胸腔内渗出液，炎性细胞浸润,肺泡壁毛细血管扩张、淤血，肺湿/干重在ANP组升高都证明在大鼠ANP时有肺损伤存在。
目前，对胰腺炎发病机制的认识已从传统的“胰酶自身消化学说”转到“炎症介质或细胞因子学说”。TNF-α、IL-6、IL-1、IL-1β、IL-8、 IL-10、IL-12、血小板活化因子（platelet-activating factor, PAF)等众多参与ANP时器官损伤的炎症介质中，TNF-α被认为是最重要的。TNF-α是天然免疫和特异性免疫的重要介质，也是联系特异性免疫和炎症反应的重要因子，低浓度是防微生物的重要因素，浓度过高，则导致一系列炎性损伤。有研究表明［3～4］ANP时TNF-α被激活的单核细胞大量释放是局部病变发展为全身炎性反应的始动因素，Cheng等［5］研究发现急性坏死性胰腺炎时，肺泡Mφ上TNF-αmRNA的表达与肺组织损伤程度密切相关。IL-6是在炎性刺激下，由多种细胞释放的介导急性相反应的主要炎症因子，其表达水平与AP的严重程度相关［6］，发病后24 h内检测血浆IL-6含量，预测ANP的敏感性为89-100％，准确性达91%［7］，是早期评价AP严重程度的最佳指标［8］。本研究发现ANP大鼠血清中TNF-α、IL-6的水平异常升高，采用蛋白免疫印记法检测肺脏中TNF-α蛋白的水平发现ANP 6h后较SO组升高了1倍多。
分析TNF-α、IL-6升高的可能原因和作用如下：TNF-α、IL-6作为前炎性细胞因子，均可受NF-κB的调控［4］。资料显示［4，9］ ANP时NF-κB在胰腺及肺脏过度活化，抑制NF-κB活化可降低肺部TNF-αmRNA表达。因此本实验中TNF-α、IL-6的高水平可能是由于过度活化的NF-KB进入细胞核、与特异的DNA位点结合、从而启动IL-6, TNF-a等基因表达的结果。此外，过度表达的TNF-α也可以刺激IL-6的产生。TNF-α作为原发性促炎症递质和继发性炎症因子的趋化因子，在其水平上调时通过促进胰腺组织及外周血单核细胞TNFR-p55/TNFR-p75 mRNA的表达上调，上调ICAM、刺激NO、氧自由基及IL-6、IL-1β等促炎因子的产生，从而引发肺部肥大细胞与血液嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放组织胺及白三烯等炎症介质，使内皮细胞内Ca2+明显增加并引起其收缩变圆，细胞间隙增加, 并增加促凝血物质活性，导致缺血和血栓形成，同时引起中性粒细胞活化，诱导内皮细胞表达黏附因子，促进多形核中性粒细胞黏附、聚集，释放弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)和溶酶体，并激活补体，使内皮细胞受损，导致肺血管通透性增加，肺间质增宽水肿，肺出血坏死和低氧血症，最终导致ARDS。IL-6可提高TNF-α介导的中性粒细胞“呼吸爆发”效应，使PMN产生更多细胞因子和炎性介质。IL-6与磷脂酶A2活化密切相关，PLA2除直接破坏肺血管、肺泡膜外，还可使PAF、TXA-2等介质大量释放，提高PMN表面PAF受体表达，使PMN活化而致内皮细胞损伤。本实验病理学检查组织损伤变化与TNF-α和IL-6的上调密切相关。
地塞米松作为糖皮质激素，具有明显的抗炎、改善微循环、清除氧自由基、抑制NF-κB的作用。本研究观察发现使用地塞米松干预后，TNF-α和IL-6出现显著下降，PaO2有所升高，血清淀粉酶较ANP组降低，肺脏和胰腺损伤程度明显减轻。这提示了地塞米松通过降低TNF-α和IL-6的水平而限制了ANP时器官损伤的炎症病理反应。地塞米松与其受体结合后进入细胞核，与IκB基启动子上的位点结合，增强IκB基因转录，使IκB蛋白产生增加，抑制NF-κB活性；同时，地塞米松受体可直接作用用于NF-κB的Rel亚基，阻断其与调控基因结合，抑制其功能。由此可进一步推测，其可通过抑制NF-κB活性途径而降低包括TNF-α、IL-6等炎症介质基因的表达的途径参与ANP时器官保护作用。
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作者单位：张家界市第一人民医院，湖南 张家界 427000；中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410000.