裸花紫珠片的微生物限度检查方法验证

【摘要】  目的 建立裸花紫珠片的微生物限度检查方法。 方法 依据《中国药典》2005年版一部附录ⅩⅢ C有关微生物限度检查法方法验证实验［1］。 结果 裸花紫珠片的微生物限度检查细菌数、霉菌数测定可采用培养基稀释法;控制菌大肠埃希菌的检查按常规法进行检验。 结论 有必要对制药企业的中药制剂进行微生物限度检查法验证。

【关键词】  裸花紫珠片 微生物限度 证

　　裸花紫珠片是由裸花紫珠为原料经提取浓缩成干浸膏后制成的薄膜衣片。其具有消炎、解毒、收敛、止血。主用于细菌感染引起的炎症，急性传染性肝炎、呼吸道和消化道出血。现将其微生物限度检查方法验证报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  裸花紫珠片，规格：含干浸膏0.5g/片。批号：700010、700020、700030；大肠埃希菌［CMCC（B）44102］、金黄色葡萄球菌［CMCCB（B）26003］、枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］、黑曲霉［CMCC（F）98003］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］，上述菌种均由海南药品检验所所提供；营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、改良马丁液体培养基、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基，以上培养基均为北京三药科技开发公司生产；稀释剂为0.9%无菌氯化钠溶液，pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

　　1.2  方法  照《中国药典》2005年版一部附录ⅩⅢ C有关微生物限度检查法方法验证实验［1］。具体操作方法如下。

　　1.2.1  验证微生物菌液的制备  ①接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24h后作为原液。取原液10ml置90ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍系列稀释，制成每1ml含菌50～100cfu（一般稀释至1∶107）的菌悬液。菌数测定采用营养琼脂培养基平皿法。②接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中,23～28℃培养24～48h后作为原液。取原液10ml置90ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍系列稀释，制成每1ml含菌数50～100 cfu（一般稀释至1∶106）的菌悬液。菌数测定采用改良马丁琼脂培养基平皿法。③ 接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上,23～28℃培养5～7d至大量孢子产生，加入3～5ml 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100 cfu的孢子悬液。孢子数测定采用改良马丁琼脂培养基平皿法。

　　1.2.2  供试液制备  取裸花紫珠片20片，置无菌三角瓶中，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，振摇使溶解，即得1：10的供试。

　　1.2.3  回收率测定  试验组供试液1ml+1ml菌液（常规法）、供试液0.2ml+1ml菌液（培养基稀释法）至平皿中,每种菌种接种10个平皿（分别接种以上5种）；分别向平皿内倒入冷却到45℃的营养琼脂或玫瑰红钠琼脂培养基15～20ml，并混合均匀；凝固后，至适温下培养。取上述制备好的5种菌液各1ml接种至平皿中，每种菌种接种2个平皿（分别接种以上5种菌种）；分别向平皿内倒入冷却到45℃的营养琼脂或改良马丁琼脂培养基15～20ml，并混合均匀；凝固后，至适温下培养；取供试液0.2ml至平皿中，霉菌和细菌各10个平皿；分别向平皿内倒入冷却到45℃的营养琼脂或玫瑰红钠琼脂培养基15～20ml，并混合均匀；凝固后，至适温下培养。

　　1.2.4  培养  将营养琼脂培养基平皿倒置于30～35℃培养48h；将玫瑰红钠琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基平皿倒置于20～28℃培养72h。
   
　　在3次的独立平行试验中，采用常规法供试品对以上5种菌种有不同程度的抗菌活性，供试品回收率为0～52%，均低于70%。采用培养基稀释法可消除供试品对人工污染以上5种菌种的抑菌作用。回收率均达到70%以上。因此，培养基稀释法（0.2ml/皿）可用于裸花紫珠片微生物限度检查。

　　1.2.5  大肠埃希菌检查验证  取经35℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物各1ml+9ml 0.9%无菌氯化钠溶液管，10倍稀释至10-7，做活菌计数备用。分别取供试液10ml接种至三瓶100ml胆盐乳糖培养基中，其中1瓶加验证用大肠埃希菌1ml（含菌数为10～100cfu）做供试品验证组；另1瓶加阴性菌对照菌株金黄色葡萄球菌1ml（含菌数为10～100cfu），作阴性菌对照组；第3瓶加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液1ml（做本底对照组），置35℃培养24h。

　　1.2.6  MUG与靛基质测定  取上述3瓶培养物各0.2ml，分别接种至6管含5ml MUG培养基的试管内，35℃培养，于5、24h在365nm紫外灯下观察，若管内呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性；观察后，分别沿3管培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性，呈试剂本色，为靛基质阴性。

　　2  结果

　　2.1  常规性和培养基稀释法对裸花紫珠片微生物限度检查的确证，结果见表1。

　　2.2  供试品大肠埃希菌污染情况，见表2。

　　表1  5种实验菌株对裸花紫片微生物限度检查（略）

　　表2  常规法检测大肠埃希菌污染情况（略）

　　供试品验证组检出大肠埃希菌，阴性菌对照组、本底对照组未检出大肠埃希菌。

　　3  结论

　　3.1  根据验证结果，确定裸花紫珠片微生物限度检查法为细菌数、霉菌数测定可采用培养基稀释法（0.2ml/皿）测定。

　　3.2  根据验证结果，控制菌的检查可用上述方法制备的供试液，按常规法进行检验。

【参考文献】
  　　［1］ 国家药典委员会.中国药典［M］.北京：化学工业出版社，2005，附录70.

作者单位：海南九芝堂药业有限公司,海南 海口 570000.