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【摘要】 目的 了解样本采集、运输和储存等过程对HIV病毒核酸检测的影响，评估在现行常规采血流程条件下进行HIV RNA NAT（nucleic acid amplification techniques）筛查的可行性。 方法 采用Roche 公司AmpliScreen HIV筛查试剂，确定本实验室条件下的检测灵敏度；模拟实际采血流程，设计不同的保存时间、保存温度和溶血程度等样本保存条件，验证以上因素对检测灵敏度的影响。 结果 本实验条件下Roche 公司AmpliScreen HIV筛查试剂检测灵敏度为10IU/ml，4℃条件下血浆保存72h对检测灵敏度无显著影响，溶血对HIV RNA筛查有严重影响。 结论 现行常规采血流程可以适合HIV RNA NAT筛查。
【关键词】 NAT 血液筛查 储存温度和时间 检测灵敏度
“窗口期”是目前血液筛查漏检的主要原因，开展核酸检测技术能缩短“窗口期”，进一步提高血液的安全性。1999年日本率先对临床用血进行NAT筛查，迄今已有欧美、澳大利亚、加拿大等20余国家开展NAT常规血液筛查。NAT血液筛查方法目前在我国尚未常规开展，但已有不少从酶联免疫吸附实验（EIA）漏检角度探讨NAT筛查意义的报道［1，2］，至于探讨具体的NAT实验适用条件报道尚不多见。按照我国血站现行常规采血、运输、检验等流程，采集的全血样本通常要经历4～6h的4℃保存，再分离出血浆；在作NAT筛查之前，血浆需要在4℃保存24～48h等待EIA结果；如要配齐标本数量，需放置更长时间。另外，采样穿刺困难、抽血时负压过大或运输过程中振荡等原因经常造成样本溶血。，针对上述因素对HIV RNA检测的影响,现进行全面评估分析，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 样本 HIV定量质控品由国家药品生物制品检定所提供，含完整病毒颗粒；5份阳性样本（S1～S5）为本室献血者筛查样本，由广东省HIV抗体确认中心实验室确认为HIV-1抗体阳性。
1.2 方法 用阴性浆对阳性标准品作梯度稀释，测定试剂盒检测灵敏度；用中度溶血血浆和严重溶血血浆稀释阳性标准品，模拟实际检测过程的样本放置时间和温度，考察溶血对NAT实验的影响；用阴性血浆稀释阳性标准品，经过不同温度和保存时间处理，考察保存温度和时间对NAT实验的影响。所有阴性浆均来自AmpliScreen试剂盒。
1.3 试剂 酶免试剂采用北京万泰生物药业有限公司人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒和生物梅里埃中国有限公司人类免疫缺陷病毒抗体（HIV-1+2）及抗原(HIV-1 P24)联合检测试剂盒；HIV核酸筛查试剂采用罗氏诊断公司AmpliScreen HIV筛查试剂盒。
1.4 仪器 Dade Behring全自动酶免分析仪，罗氏诊断公司Roche COBAS PCR分析仪。
2 结果
2.1 试剂灵敏度 用阴性浆对国家药品生物制品检定所提供的HIV定量质控品1.8×104 IU/ml作梯度稀释，按照说明书操作，AmpliScreen HIV筛查试剂盒的灵敏度可达10 IU/ml。结果数据见表1。
表1 COBAS AmpliScreen HIV Test检测限浓度（略）
注：对250 IU/ml、200 IU/ml两个浓度作单次检测；对25 IU/ml浓度作4次重复检测；对10IU/ml浓度作10次检测；其余浓度作2次重复检测，结果均为阳性。
2.2 保存温度和时间对HIV RNA检验的影响：
2.2.1 用阴性浆将HIV阳性质控品稀释到设定浓度，每个浓度4份，均匀分为两组，分别在4℃和室温放置72h。按照说明书进行检测, 4℃保存组有1个10IU/ml的样本检测结果为阴性；室温保存组5IU/ml和10IU/ml浓度各有1个样本结果为阴性。详细结果见表2。
表2 HIV阳性血浆标本保存温度对HIV RNA检测结果的影响（略）
2.2.2 为了进一步验证以上结果，随机抽取5份HIV 抗体阳性样本（S1～S5）（EIA滴度≥105），每个样本取2ml，分成2份,分别在4℃和室温放置72h，然后与阴性浆依照标准筛查模式按照24样本混合检测，结果见表3。
表3 不同温度条件下，血浆样本保存72h对HIV RNA检测结果的影响（略）
2.3 溶血（未做定量检测）对HIV RNA筛查的影响 为了验证不同程度的溶血对HIV RNA检验的影响，我们选择HIV EIA阴性的中度溶血样本和严重溶血样本，分别将阳性质控品稀释到设定浓度，分别在4℃和室温放置6h，然后作核酸检测，结果包括1 000 IU/ml的高滴度样本在内，无1例检测到核酸阳性，见表4、表5。
表4 中度溶血样本不同温度条件下保存6h对HIV RNA检测结果的影响（略）
表5 严重溶血样本4℃保存6h对HIV RNA检测结果的影响（略）
3 讨论
罗氏诊断公司Ampliscreen HIV NAT标准筛查模式为24样本混合（pooling）检测，表1结果表明，罗氏诊断公司AmpliScreen HIV筛查试剂盒在本室实验条件下，灵敏度为10IU/ml，意味着单个浓度为480IU/ml的HIV阳性样本与23个阴性样本混合后得到的浓度为20IU/ml的样本可检出阳性。文献［3］报道，HIV初次感染，数天时间内病毒载量可从每1 000 ml几个病毒，迅速增加到50 Copies/ml，而从50 Copies/ml到720 Copies/ml只需要几个小时。表2结果表明，20IU/ml样本4℃放置72h后HIV RNA检出率为5/6,室温放置72h后检出率为4/6。表3结果表明，对阳性样本（EIA滴度≥105），4℃或室温放置72h，样本仍适合HIV RNA检测。因此，血浆样本在4℃保存不超过72h，可以用于NAT HIV筛查，这与G Gessoni等报道的结论一致［4］。
表4、表5结果表明溶血严重干扰HIV RNA检测，溶血样本不适合作HIV RNA检测。有研究认为，标本溶血对核酸检测影响的可能机制：破裂红细胞释放出大量血红蛋白，通过对Taq酶的抑制作用干扰核酸检测［5］。实验表明血红蛋白的浓度高于5.89μg/L时即可致使测定结果偏低［6，7］。内对照（Internal Control）是一段人工合成的RNA 片段，在核酸提取的第一步，含有内对照的样本裂解液加入到各个样本中，与样本经历完全相同的核酸提取步骤，最后与源自HIV病毒颗粒的模板RNA同时进入PCR扩增、检测程序。表4结果显示：中浓度溶血处理样本的内对照结果均为阳性；而浓度高达1 000 IU/ml的高病毒滴度样本为阴性。表5显示严重溶血同时抑制内对照和样本的PCR扩增。综合考虑以上实验结果，和本实验采用的核酸提取方法，我们推测：发生溶血时，从红细胞中释放出RNase、DNase等酶类，直接降解样本中的病毒颗粒和从病毒颗粒中释放出的核酸。含有内对照的样本裂解液加入到各个样本后，裂解液中的变性剂抑制酶类的降解作用，保护内对照和残余的病毒颗粒和病毒核酸不受降解。在核酸提取的最后步骤，洗脱液将核酸从蛋白沉淀中洗出，沉淀中会有少量血红蛋白复溶于核酸洗脱液，这些复性的血红蛋白会参与并抑制下一步的PCR循环。对于表4的结果，我们可以这样理解：在加入裂解液之前，样本中的HIV颗粒已经被破坏，HIV RNA已经降解。在样本提取的最后步骤，从蛋白沉淀中仅仅有很少量血红蛋白复溶于核酸洗脱液，对后续的PCR扩增影响不明显，内对照的扩增检测结果正常。对于表5的结果，我们可以这样理解：在加入裂解液之前，样本中的HIV颗粒已经被破坏，HIV RNA已经降解。在样本提取的最后步骤，从蛋白沉淀中有比较大量血红蛋白复溶于核酸洗脱液，对后续的PCR扩增影响明显，抑制内对照的扩增检测，内对照结果阴性。如果样本中原有的病毒数量较少，就可能造成检测结果假阴性。
RNA不稳定、易降解，一般要求样本4℃保存条件下6h内进行检测，显然，现行常规采血流程条件下难以满足上述要求。通过模拟现行常规采血流程，我们发现罗氏诊断公司AmpliScreen HIV筛查试剂盒可以适合现行常规采血流程HIV RNA NAT筛查，4℃条件下血浆保存72h对检测灵敏度无显著影响，溶血样本不适合HIV RNA筛查。我们对现行常规采血流程条件下HIV RNA 筛查的影响因数进行评估，旨在探索出一条适合本地区的筛选流程和方法，为NAT实验的普及奠定基础，为卫生行政部门决策提供参考依据。
【参考文献】
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作者单位：东莞市中心血站，广东 东莞 523930； 东莞理工学院，广东 东莞 523932.