细胞色素P450 2C9基因多态性对药物代谢的影响

【摘要】  不同的人种和个体间存在细胞色素P450 2C9（CYP2C9）基因多态性，这些基因多态性的个体对药物的代谢有明显的差别。现就目前关于CYP2C9基因多态性的研究概况进行综述，分析CYP2C9基因多态性产生的分子基础， CYP2C9基因多态性对底物药物代谢的不同影响,阐明基因多态性的信息可作为用药剂量个体化的理论依据，从而指导临床药物的使用更加合理和科学。

【关键词】  细胞色素P450 2C9 基因多态性 药物代谢

　　细胞色素P450(CYP)是肝脏重要的药物代谢复合酶系，能催化许多外源性和内源性物质的合成和分解代谢反应，CYP酶系包含很多家族成员，到目前为止,已知哺乳动物有14个CYP基因家族,36个基因亚家族,主要为CYP1-CYP4 4大家族,其中研究最多的有CYP1A、CYP2A6、CYP2D6、CYP2C、CYP2E1和CYP3A等，在这些家族中又以CYP2C家族成员的研究最为清楚［1］。CYP2C的蛋白质合成后，通过靶向运输，主要定位于肝微粒体中,也有少量定位于线粒体；这些酶的基因位于第10号染色体上(10q2411～2413)；在CYP2C酶复合体成分中，CYP2C8、CYP2C9、CYP2C18及CYP2C19是4个重要的CYP2C酶,它们在肝中的相对含量是35∶60∶4∶1［2～3］。CYP2C9酶是CYP2亚族中含量最丰富的酶,也是人类第一个得到结晶和分析反应底物的CYP［4］。CYP有特异的催化底物，CYP2C9的底物包括抗凝剂华法林(warfirin)、各种弱酸性药物如苯妥英(phenytoin)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、洛沙坦、托塞米，还有许多非甾体类抗炎药,如布洛芬、双氯芬酸和萘普生等。CYP2C9能转化或活化许多种药物、前致癌物、前毒物和致突变剂,催化约12%的临床常用药物［5］，所以CYP2C9的活性在药物的代谢中占有非常重要的位置。尽管CYP2C9在体内能促进或抑制这些药物的代谢，但是在正常人群却有明显的个体差异，这些差异可能是由于CYP2C9基因的表达或基因型的差别引起，特别是对一些治疗剂量范围较窄的药物，由于CYP2C9存在遗传多态性，在用药时必须考虑由于CYP2C9的基因多态性对药物代谢产生的不同影响，这样才能更好地保证用药的安全性。

　　1  CYP2C9的基因结构多态性
         
　　上世纪七十年代后期，Scott等人在研究甲苯磺丁脲的甲基羟化代谢过程中发现人群中发现存在个体的差异，认为是由于人群CYP基因多态性引起，尽管后来Veronese等人在106名健康白人中未发现甲苯磺丁脲羟化代谢的两态分布，但更多的研究均表明甲苯磺丁脲和苯妥英的羟化代谢确实具有CYP多态性特点［6～7］，现认为其根本原因在于CYP2C9具有遗传多态性。大量研究表明CYP2C9在人类存在几种等位基因突变体［2,8,9］,其中最主要的有3种即野生型(CYP2C9*1)、R144C突变体(CYP2C9*2)和I359L突变体(CYP2C9*3)，并已在不同的种族得到证实。根据Hardy-Weinberg准则，在对甲苯磺丁脲和苯妥英羟化代谢的PM（poor metabolizer）发生机制的研究中，Wang等人利用PCR-核酸内切酶消化法检测CYP2C9cDNA中的点突变，结果显示CYP2C9共有4个点突变，第1个突变为第3外显子C430-T转变,Arg144(CGC)代替了Cys144(TGC)造成氨基酸发生改变，导致该处的一个AvaII位点丢失；第2个突变为第7外显子A1059-G(Cys358-Tyr)，第3个突变也出现在第7外显子由C1061替代A，相应氨基酸发生Ile359-Leu的改变，这两个突变均可导致一个NsiI位点的丢失［5］；第4个突变为第8外显子A1236-G引起氨基酸残基Gly417替代Asp417导致一个HphI位点的丢失。研究表明，Arg144/Tyr358/Ile359/Gly417为CYP2C9的主要等位基因，常表示为野生型(CYP2C9*1)，因Tyr358/Gly417在不同实验室所有的个体研究中几乎均表现为纯合子，说明这两个等位基因不太可能代表CYP2C9的遗传多态性。第1和第3个点突变分别表示为R144C(CYP2C9*2)和I359L(CYP2C9*3)，它们在人群中具有一定的发生频率并具有种族差异，其中白人稍高于亚洲人，这两种突变频率在白人人群中为0.2%［4,7,8］。

　　2  作用底物或其他药物对CYP2C9活性的影响
         
　　CYP2C9的活性和表达程度受底物的影响。CYP2C9的表达无性别、年龄差异，但饮食、健康状况和长期饮酒有可能影响其活性。CYP2C9蛋白含有一个能被细胞色素b5识别并对其产生激活作用的位点即Arg-Arg-Phe-Ser，这个位点经cAMP依赖性激酶作用下，进行氨基酸残基Ser磷酸化修饰后能被细胞色素b5识别，进而导致对该酶的激活；当Ser被Cys代替时，如CYP2C18则细胞色素b5失去对该酶的激活作用。CYP2C9能代谢许多药物但同时又有许多药物可影响其活性的表达。目前已知能够诱导CYP2C9活性表达的药物有卡马西平、苯巴比妥和利福平等［10］；而能抑制其活性的物质有磺胺、安替比林、双香豆素、氯霉素、西米替丁、保泰松、苯磺唑酮、唑类抗真菌药和选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)等［11～12］，另外，噻吩利尿酸作为CYP2C9的自杀型底物也可引起CYP2C9的失活。必须指出的是个体本身在没有底物诱导也可表现出活性的差别，例如CYP2C9等位基因的突变体(R144C和I359L)在不同生物系统中表达时，其相应的酶蛋白活性均低于野生型［9］。所以，阐明影响CYP2C9活性的因素对于认识临床上药物-药物相互作用的机制具有重要价值。

　　3  不同底物对CYP2C9基因型的作用及其对药物代谢的影响
         
　　近年来底物药物对CYP2C9活性诱导机制的研究取得不少进展。利福平和苯巴比妥能在体内诱导CYP2C亚家族的代谢,Morel等［13］报道在人类原代肝细胞中，用利福平、地塞米松和苯巴比妥处理后,CYP2C的免疫蛋白和信使RNA的水平上升；也有研究证明在人类原代肝细胞中苯巴比妥,利福平和地塞米松能上调CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19的转录水平［14］。最近的研究表明PXR(孕烷活化受体)、GR(糖皮质激素受体)、CAR(构成性雄烷受体)能调节CYP2C9表达。Sabine等在人类肝细胞中运用诱导剂能在mRNA及蛋白质水平诱导CYP2C9表达［15］。基因缺失分析证明在CYP2C9的调控区(+21到-2088)存在两种不同核激素受体结合的功能性反应元件——糖皮质激素受体反应元件(-1648/-1684)和构成性雄烷受体反应元件,据报道糖皮质激素反应元件位于不完全回文-1662/-1676序列中,而在-1803/-1818序列鉴别的DR4配体分别被糖皮质激素受体,hCAR和PXR受体激活。这些功能性元件的鉴别对于地塞米松,利福平及苯巴比妥诱导CYP2C9提供了一个合理的解释［16］。
         
　　CYP2C9遗传多态性对作用底物或其他药物代谢可产生不同的影响。CYP2C9遗传多态性的I359L(CYP2C9*3)突变可显著降低甲苯磺丁脲和苯妥英的代谢率，Takanashi等在体外观察了I359L(CYP2C9*3)突变对CYP2C9的7种底物的代谢动力学特征的影响，发现CYP2C9的代谢活性均显著降低，降低程度因药物而异［10］。人体内试验表明CYP2C9*3纯合子个体的药物清除率显著低于CYP2C9*1纯合子个体［2］。但是R144C(CYP2C9*2)对CYP2C9酶活性的影响相对较小［3,5］。进一步分析显示在包括144位点的区域内有一个与CYP101氨基酸序列相似的a-螺旋结构，当144位点发生Arg到Cys的突变时，这种a-螺旋结构遭到破坏，导致R144C蛋白结构和功能发生变化，359位的氨基酸位于CYP2C9-底物识别位点(SRSs)区域内，该区域含有一个与CYP101氨基酸序列排列相似的β-链结构。Ile359到Leu的突变可以造成这个结构的破坏，从而影响I359L蛋白的结构和功能，导致CYP2C9对甲苯磺丁脲的代谢发生改变。Sullivan-Klose等人［17］发现一个甲苯磺丁脲的弱代谢者（poor metabolizer，PM）为Leu359纯合子和Arg144/Cys杂合子;另外有人发现一个甲苯磺丁脲的PM为Arg144和Leu359等位基因的纯合子，提示I359L突变可导致CYP2C9活性丧失［7,18］。最近研究发现，CYP2C9的遗传多态性对多种药物代谢有明显的影响,例如Nateglinide是口服的降血糖药物，它的清除是通过肝脏的生物转化和肾小管排泌来实现的。在对多种CYP2C9基因型的健康人分析中发现，CYP2C9*3/*3型对药物Nateglinide的清除率明显低于CYP2C9*1/*1型［19］，因而由于有遗传多态性的存在，在给予Nateglinide治疗时可能会引起隐性的遗传高血糖；又有研究采用口服葡萄糖的方法，观察格列本脲（glyburide）和吡罗昔康（Piroxican）对胰岛素、血糖变化的影响，发现CYP2C9基因多态性也表现出glyburide和Piroxican代谢的明显差别，CYP2C9*1/*2和CYP2C9*1/*3在药物代谢动力学参数AUC（area under the plasma concentration-time cure, AUC）指标比CYP2C9*1/*1基因型明显降低，而在清除时间半寿期t1/2指标则比CYP2C9*1/*1基因型明显延长［20～21］；华法林（warfarin）是常用的抗血液凝固和抗血栓形成药物，研究发现，对于CYP2C9*1/*3基因型的个体，在首过剂量的warfarin治疗时，出现抗凝血的过大反应，并继发出血［22］，也有研究显示，warfarin的体内代谢和剂量的维持受CYP2C9基因多态性、人种因素的影响［23］。这些研究结果提示，CYP2C9基因多态性在其作用底物的代谢中，是一个非常值得考虑的因素，CYP2C9基因多态性受其底物的诱导或抑制，都可能产生对药物清除的加快或减慢的影响，这些多态性的存在，是遗传药理学面临的重要课题。

　　4  展望
         
　　目前,CYP2C9的氨基酸序列已经测定,分析发现在人群中约有1/500呈现多态性［24～25］。研究发现不仅在CYP2C9基因的编码区域存在多态性,而且在基因的启动子也存在着高度多态性。这些基因多态性能影响作用底物或其他药物的代谢，基因多态性所表达酶活性与个体间药物代谢的差异紧密相关,并且会影响临床疗效。所以了解基因多态性能促进CYP2C9的底物药物的用药剂量个体化，特别是对一些底物如华法林,双香豆素,那格列奈（Nateglinide）,苯妥英，吡罗昔康（Piroxican）等治疗指数狭窄,在弱代谢者(PM)中,尤其是CYP2C9*3/*3个体中可能会产生严重的药物毒性。因此，有人提出“药物百家姓”学说有它的遗传学依据。最近有研究发现，用华法林治疗美国的欧洲人、美国的非洲人和美国的亚洲人，发现对华法林剂量的反应有明显的区别，单核苷酸多态性分析显示，主要原因是由于这些人种有维生素K环氧化物还原酶5种单纯基因型存在，这些基因型的mRNA表达水平有很大的差异［26］。这些研究结果提示，对药物代谢的影响已经扩展到基因多态性的新领域，所以通过对肝药酶CYP2C9等基因多态性的分析，利用这些基因多态性的信息来指导临床用药,将会更加合理和科学。

【参考文献】
  　　［1］ Miners JO, Birkett DJ. Cytochrome P450 2C9: an enzyme of major importance in human drug metabolism［J］. Br J Clin Pharmacol, 1998，45 (6): 525～538.

　　［2］ Gray IC , Nobile C , Muresu R, et al . A 2.4-megabase physical map spanning the CYP2C gene cluster on chromosome 10q24［J］. Genomics, 1995，28 (2) :328～332.

　　［3］ Goldstein JA, Faletto MB , Romkes-Sparks M，et al . Evidence that CYP2C19 is the major S-mephenytoin 4’-hydroxylase in humans［J］. Biochemistry, 1994，33 (7) :1743～1752.

　　［4］ Rettie AE, Jones J P. Clinical and toxicological relevance of CYP2C9: Drug-Drug interactions and pharmacogenetics［J］. Annual Review of Pharmacology & Toxicology, 2005，45: 477～484.

　　［5］ Yamazaki H, Inoue K, Shimada T. Roles of two allelic variants (Arg144Cys and Ile359Leu) of cytochrome P450 2C9 in the oxidation of tolbutamide and warfarin by human liver microsomes［J］. Xenobiotica, 1998，28 (2):103～115.

　　［6］ Scott J, Poffenbarger PL. Pharmacogenetics of tolbutamide metabolism in humans［J］. Diabetes, 1979，28(1): 41～51.

　　［7］ Veronese ME, Miners JO, Rees DL, et al.Tolbutamide hydroxylation in humans: lack of bimodality in 106 healthy subjects［J］. Pharmacogenetics, 1993，3(2): 86～93.

　　［8］ Stubbins MJ, Harries LW, Smith G, et al. Genetic analysis of the cytochrome P450 2C9 locus［J］. Pharmacogenetics, 1996，6 (5): 429～439.

　　［9］ Nasu K, Kubota T, Ishizaki T. Genetic analysis of CYP2C9 polymorphism in a Japanese population［J］. Pharmacogenetics, 1997，7(5):405～409.

　　［10］ Takanashi K, Tainaka H, Kobayashi K, et al. CYP2C9 Ile359 and Leu359 variants: enzymekinetic study with sevens ubstrates［J］. Pharmacogenetics, 2000，10(2):95～104.

　　［11］ Bu HZ, Magis L, Knuth K,et al. High-throughput cytochrome P450 (CYP) inhibition screening via a cassette probe-dosing strategy. VI. Simultaneous evaluation of inhibition potential of drugs on human hepatic isozymes CYP2A6, 3A4, 2C9, 2D6 and 2E1［J］. Rapid Commun Mass Spectrom, 2001，15 (10): 741～748.

　　［12］ Mancy A, Dijols S, Poli S, et al. Interaction of sulfaphenazole derivatives with human liver cytochromes P450 2C: molecular origin of the specific inhibitory effects of sulfaphenazole on CYP 2C9 and consequences for the substrate binding site topology of CYP 2C9［J］. Biochemistry, 1996，35(50): 16205～16212.

　　［13］ Morel F, Beaune PH , Guillouzo A， et al . Expression of cytochrome P2450 enzymes in cultured human hepatocytes［J］ . Eur J Biochem , 1990，191(2) :437～444.

　　［14］ Sabine GC, Pascussi JM, Pichard-Garcia L， et al. Induction of CYP2C genes in human hepatocytes in primary culture［J］. Drug Metab. Dispos, 2001，29(3): 242～251.

　　［15］ Sabine GC, Daujat M, Pascussi JM, et al. Transcriptional regulation of CYP2C9 gene. Role of glucocorticoid receptor and constitutive androstane receptor［J］. J. Biol. Chem，2002，277(1): 209～217.

　　［16］ Pascussi JM, Sabine GC, Drocourt L, et al. The expression of CYP2B6, CYP2C9 and CYP3A4 genes: a tangle of networks of nuclear and steroid receptors［J］. Biochim Biophys Acta, 2003，1619(3): 243～253.

　　［17］ Sullivan-Klose TH, Ghanayem BI, Bell DA,et al.The role of the CYP2C9-Leu359 allelic variant in the tolbutamide polymorphism［J］. Pharmacogenetics, 1996， 6 (4): 341～349.

　　［18］ Bhasker CR, Miners JO, Coulter S, et al. Allelic and functional variability of cytochrome P4502C9［J］. Pharmacogenetics, 1997，7(1): 51～58.

　　［19］ Ingolf M, Goran M, Steffen B, et al. Influence of CYP2C9 and CYP2D6 Polymorphisms on the pharmacokinetics of nateglinide in genotyped healthy volunteers［J］. Clinical Pharmacokinetics, 2004，43 (4): 267～278.

　　［20］ Yin OQ, Tomlinson B, Chow MS. CYP2C9, but not CYP2C19, polymorphisms affect the pharmacokinetics and pharmacodynamics of glyburide in Chinese subjects［J］. Clin Pharmacol Ther, 2005，78 (4): 370～377.

　　［21］ Perini JA, Vianna-Jorge R, Brogliato A，et al. Influence of CYP2C9 genotypes on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of piroxicam［J］. Clin Pharmacol Ther, 2005，78 (4): 362～369.

　　［22］ Dorothy M A, Charles K, Domnita C, et al. Effect of polymorphisms in the cytochrome P450 CYP2C9 gene on warfarin anticoagulation［J］. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 2004，128 (12):1360～1363.
　　
　　［23］ Herman D, Locatelli I, Grabnar I, et al. Influence of CYP2C9 polymorphisms, demographic factors and concomitant drug therapy on warfarin metabolism and maintenance dose［J］. Pharmacogenomics, 2005，5 (3):193～202.

　　［24］ Borlak J, Thum T. Identification of major CYP2C9 and CYP2C19 polymorphisms by fluorescence resonance energy transfer analysis［J］. Clin. Chem. 2002，48(9): 1592～1594.

　　［25］ Zainuddin Z, Teh LK, Suhaimi AW, et al. A simple method for the detection of CYP2C9 polymorphisms: nested allele-specific multiplex polymerase chain reaction［J］. Clin Chim Acta，2003，336(1-2): 97～102.

　　［26］ Rieder MJ, Reiner AP, Gage BF, et al. Effect of VKORC1 haplotypes on transcriptional regulation and warfarin dose［J］. N. Engl. J. Med., 2005，352 (22): 2285～2293.

作者单位：海口市人民医院检验科，海南 海口 570208; 海南医学院生理学教研室,海南 海口 571101.