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【摘要】 目的 探讨血管紧张素转化酶抑制剂福辛普利对骨关节炎软骨结构的影响。 方法 新西兰大白兔24只，分为正常对照组、安慰剂组和治疗组，每组8只。安慰剂组和治疗组通过前交叉韧带切断法（ACLT）建立兔右膝骨关节炎模型，安慰剂组给予维生素C 10mg/kg/日口服；治疗组给予福辛普利0.5mg/kg/日口服。2月后处死所有实验动物，取膝关节软骨进行结构评定并进行免疫组化测定MMP-1、MMP-9和iNOS；RT-PCR测定软骨组织内iNOS-mRNA的表达。 结果 与安慰剂组比较，治疗组兔膝关节软骨结构破坏明显减轻（P＜0.01）；治疗组膝关节软骨内MMP-1、MMP-9显著含量降低（P＜0.05），iNOS和iNOS-mRNA也降低，但无统计学意义。 结论 福辛普利能减轻兔膝骨关节炎症的软骨破坏，这可能与其抑制一些炎性损伤因子对软骨的降解作用。
【关键词】 骨关节炎 福辛普利 基质金属蛋白酶 软骨降解
Experimental study on the treatment of rabbit arthritis with fosinopril.
LI Jie-yi, LIU Fang, ZUO Yu, et al.
(Yueyang Municipal Second People’s Hospital, Yueyang 414000, Hunan, P. R. China)
Abstract：Objective To observe the effects of fosinopril , an angiotensin- converting enzyme inhibitor on the development of cartilage structural changes in an experimental rabbit model of osteoarthritis (OA). Methods Twenty four New Zealand rabbits were divided into control,placebo and fosinopril groups each consisted of 8 rabits. OA was surgically induced in rabbits by sectioning the anterior cruciate ligament(ACLT). OA rabbits were randomly divided into two groups and treated orally with 1) placebo, 10mg/kg/day of Vitamine C; 2) 0.5mg/kg/day of fosinopril, the normal rabbits were taken as control. All rabbits were killed2 months after surgery. The severity of the lesions was recorded by macroscopical and histological examination. Cartilage specimens from the femoral condyles were processed by immunohistochemistry to evaluate the levels of iNOS, MMP-1, MMP-9; and quantitative reverse transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to study the messenger RNA levels of iNOS. Results Treatment with fosinopril reduced the development of cartilage lesions (P<0.01). Immunohistochemical analyses showed that treatment with fosinopril significantly reduced the synthesis of some key OA mediators: MMP-1、MMP-9 (P<0.05). Quantitative RT-PCR showed that fosinopril reduced the expression of iNOS in OA cartilage, but without statistics difference. Conclusion Fosinopril can reduce the progress of cartilage structural changes in a rabbit model of OA. The effect is associated with the inhibition of the major pathophysiologic mediators responsible for cartilage degradation.
Key words：Osteoarthritis(OA); Angiotensin-converting enzyme inhibitor (ACEI); Matrix metalloproteinases (MMPs); Cartilage degradation
关节软骨细胞外基质的降解是骨关节炎（OA）产生的主要原因，骨关节炎的生物化学改变主要发生于软骨的两种主要基质成分:蛋白多糖和Il型胶原。以往的研究证明基质金属蛋白酶(MMPs )是导致细胞外基质(ECM)变性最重要的酶，在关节软骨细胞外基质成分降解中起关键作用［1］。另外，各种炎性细胞因子如IL-1、TNF-a 、NO等可诱导多种ProMMPs（基质金属蛋白酶原）的产生，参与软骨细胞外基质的破坏［2,3］。在心血管系统疾病研究中，发现长期使用血管紧张素转化酶抑制剂能抑制心肌和循环中IL-1β、TNF-α和MMPs的表达［4,5］，而这是否也能抑制OA患者关节软骨中IL-1β、TNF-α和MMPs的表达，目前尚无研究报道。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 新西兰兔24只，雌雄各半，体重(2.5士0.2)kg，随机分为正常组、安慰剂组和实验组，每组各8只。安慰剂组和实验组均在50g/L的氯安酮100mg/kg静脉麻醉下行右侧ACLT术建立OA模型［6］。术后3d内每只兔每天肌注青霉素40万U预防感染，伤口络合碘护理，3d后每天自由放养8h。将安慰剂维生素C 10mg/kg/d和福辛普利0.5mg/kg/d（上海施贵宝制药有限公司）分别混于饲料中，术后第二天开始分组给药。
1.2 大体观察 术后2月空气注射处死动物，取股骨裸和胫骨平台关节面，观察关节软骨溃疡发生及深度，并照相和详细记录，采用Mias system 4.1医学图像分析管理系统分析比较各组关节软骨溃疡面积；根据溃疡浸润的深度（正常，浸润至软骨浅、中、深层，骨质）分为0～4级［7］。
1.3 光镜观察 矢状位切取股骨内骸软骨退变区的全层软骨作软骨标本，置于4%多聚甲醛固定24h，逐步脱水，浸蜡，包埋。作6mm连续切片，做Safranin O染色［8］。观察染色的深浅及是否均匀（0～4分），有无纤维、血管增生（0～1分），软骨结构改变（0～6分）、细胞增生及细胞排列情况（0～3分）。
1.4 软骨MMP-1，3和iNOS的检测 软骨标本经固定、石蜡包埋后，5μm连续切片，脱蜡至水，MMP-1检测用0.01M柠檬酸缓冲液中微波修复抗原5min，温度98℃；MMP-3，9和iNOS的检测用含0.25U/ml的硫酸软骨素酶PPS液在37℃孵育60min。0.3%过氧化氢37℃浸泡15min；正常兔血清37℃封闭60min后吸干；加入一抗（鼠抗兔）MMP-1（中山生物技术公司产品）、MMP-9（中山生物技术公司产品）、iNOS（200μg/ml，Santa Cruz公司产品）血清于4℃过夜；生物素化羊抗兔IgG孵育20min, 37℃；辣根过氧化物酶标记链卵白素工作液孵育20min, 37℃；二氨基联苯胺(DAB)染色，苏木精复染；二甲苯透明，中性树胶封片。用非免疫的鼠血清代替一抗作免疫组化阴性对照。形态计量参考Pelletier等的方法［9］，选临近退变部位的软骨，选取6个高倍视野，一半位于表层和中上层，一半位于中下层和下层进行观察，计算每个视野的阳性细胞数和细胞总数。表达量为阳性细胞数占细胞总数的百分数。
1.5 iNOS-mRNA检测 用TRIzol提取总RNA，半定量RT-PCR法检测iNOS-mRNA的表达(GIBCO公司试剂盒)。（1）逆转录: 反应体系40μl,总RNA 5μg。（2）PCR反应体系25μl,含cDNA模板2.5μl, 10×buffer 2.5μl,2.5mmol/L的MgCl2 1.5μl, 4×dNTPs 2.0μl, 引物各为20pmol, TaqDNA 聚合酶1U,同时每管内加入10pmol GAPDH引物作为内参照,共扩增30个循环。PCR引物序列和反应条件及产物长度如下：homo-GAPDH引物5’-AGGCTGTGGGCAAGGTCATC-3’，5’-AAGGTGGAA GAGTGGGTGTC-3’。iNOS 5’-CATGAAGTACATGCAGAGCG-3’，5’-GCAAGGCGCAGCTGAACAAG-3’。95℃变性5min后, 按94℃变性1min，56℃退火2min，72℃延伸1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。(3)1.5%琼脂糖凝胶电泳后用Pharmacia 凝胶成像仪观察，并用Imagemaster分析软件分析条带峰面积,计算iNOS/GAPDH峰面积比值为每个样本iNOS-mRNA的表达水平。
1.6 统计学分析 采用SPSS 11.0 软件进行统计学处理，应用单因素方差分析（ANOVA法）进行组间分析,以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 膝关节软骨骨质破坏情况比较 评价指标包括关节软骨溃疡体积评分和显微镜下组织评分，溃疡评分=溃疡面积×浸润深度。对照组关节软骨结构正常，福辛普利组膝关节软骨骨质破坏情况(关节软骨溃疡体积评分和显微镜下组织评分)明显好于安慰剂组，见表1，图1～2。
表1 各组关节软骨破坏情况比较（略）
注：*P<0.05；#P<0.01。
图1 三组关节软骨溃疡情况比较（略）
A:正常组骨关节面光滑,表面无溃疡形成; B:安慰剂组骨关节表面溃疡形成,色泽暗红,面积较大; C:福辛普利组溃疡面积明显减少。
图2 三组关节软骨显微下组织评分比较（略）
A:正常组关节软骨面光滑,染色均匀; B:安慰剂组关节软骨染色不均匀,软骨破坏,细胞排列紊乱; C:福辛普利组关节软骨染色欠均匀,软骨面基本平整,细胞排列基本均匀。×200
2.2 各组膝关节软骨MMPs、iNOS和iNOS-mRNA表达情况 免疫组化法定量测定软骨组织中MMP-1、MMP-9和iNOS的表达情况，测定5个高倍视野中阳性细胞所占的百分数。发现MMP-1和MMP-9在福辛普利组膝关节软骨组织中明显降低（P<0.05），iNOS也降低，但无统计学意义；半定量RT-PCR法检测软骨中iNOS-mRNA的表达，在福辛普利组膝关节软骨细胞中的表达量也轻微降低，但也无统计学意义。见表2，图3～6。
表2 各组关节软骨MMPs、iNOS和iNOS-mRNA表达情况比较（略）
注：*与安慰剂组比较,P<0.05；#与对照组比较,P<0.01。
3 讨论
骨关节炎是由一些复杂机制导致关节的进行性破坏，主要由于关节软骨细胞外基质的降解，导致了关节软骨功能降低，继而对机械压力的抵抗减弱而出现进行性关节软骨病损。关节软骨细胞外基质的降解由多种蛋白酶和因子参与，其中基质金属蛋白酶(MMPs )和一氧化氮（NO）是导致细胞外基质(ECM)变性、降解最重要的分解因子，在OA形成中起关键作用［10,11］。
图3 MMP-1阳性细胞的表达情况比较（略）
A为正常组,B为安慰剂组,C为福辛普利组,D为阴性对照。棕褐色颗粒为MMP-1阳性表达的细胞。B与C比较,P<0.05。×200
图4 MMP-9阳性细胞的表达情况比较（略）
A为正常组,B为安慰剂组,C为福辛普利组,D为阴性对照。棕褐色颗粒为MMP-9阳性表达的细胞。B与C比较,P<0.05。×200
图5 iNOS阳性细胞的表达情况比较（略）
A为正常组,B为安慰剂组,C为福辛普利组,D为阴性对照。棕褐色颗粒为iNOS阳性表达的细胞。B与C比较,P>0.05。×200
图6 iNOS-mRNA表达情况比较（略）
A为正常组,B为安慰剂组,C为福辛普利组。B与C比较,P>0.05。
福辛普利是一种血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI），同时也可抑制激肽酶，对缓激肽产生降解作用。在心血管疾病的研究中，发现ACEI可抑制炎性因子IL-1β［4］、TNF-α［5］和ICAM-I［12］的表达,减轻组织慢性炎症反应；也可通过抑制MMP-2、MMP-9的表达，改变心肌梗死区的胶原代谢［13］。而炎性因子IL-Iβ和TNF-α，分解代谢因子MMPs和NO等在软骨降解和OA形成中发挥重要作用，故设想ACEI类药物可能对OA的治疗有一定的作用。在本研究中我们证实福辛普利能抑制兔骨关节炎软骨的破坏和软骨中MMPs的表达降低。MMPs是一类依赖锌离子的蛋白酶家族，有许多亚型，主要为:胶原酶(MMP-1, MMP-8, MMP-13)；明胶酶(MMP-2,MMP-9)；基质溶解素(MMP-3, MMP-7, MMP-10)。MMP-1特异性降解天然I、II型胶原，而II型胶原是关节软骨胶原网的主要成分，IL-1β和NF-α通过炎性反应转录因子（SAF-1）和c-Jun/c-Fos 刺激MMP-1的表达，促使II型胶原降解、基质成分游离出软骨，导致软骨破坏［14］；MMP-3能消化吸收蛋白多糖，同时也是ProMMP-1(基质金属蛋白酶原-1)和ProMMP-9(基质金属蛋白酶原-9)的特异性激活剂，促使胶原的降解［1］。Balkman等［15］发现MMP-3的mRNA在正常关节软骨及滑膜为低水平表达而OA病人为高水平表达；MMP-9可来自外周血中性粒细胞和单核细胞，特别是血多形中性粒细胞分解后可释放大量MMP-9，关节软骨可产生MMP-2和MMP-9，但其滑膜成纤维细胞仅生成MMP-2，说明由外来的和局部的细胞产生酶类共同作用导致关节成分的消化［16］。在本研究中，我们发现长期服用福辛普利能降低OA关节软骨中MMP-1和MMP-9 的表达，减轻关节软骨的破坏和降解，这与其能抑制前炎性因子IL-1β［4］、TNF-α［5］和ICAM-I［12］等在组织的表达有关,减轻炎性因子刺激组织高表达MMPs，但具体机制有待进一步研究。
在正常情况下，NO起着宿主防御作用，但高浓度的NO［17］可抑制蛋白多糖的合成；激活基质金属蛋白酶，促进基质的降解［18］；影响胶原的代谢；抑制软骨细胞的增殖，促进软骨细胞的凋亡，使滑膜肿胀淤血等［19］。抑制iNOS和NO的表达，能促进OA关节软骨的修复［20］。福辛普利可抑制激肽酶，在内皮细胞中能增强BK- NO（缓激肽-一氧化氮）信号通路的表达［21］。但在NO能度高OA组织中，本研究发现血管紧张素转化酶抑制剂福辛普利并不增加软骨组织中iNOS和iNOS-mRNA的表达，这可能与ACEI类药物能提高组织对NO的利用度有关，但具体机制不明确。
总之，长期使用血管紧张素转化酶抑制剂剂福辛普利其能降低OA软骨组织中MMP-1，9的表达，减轻OA关节软骨的降解与破坏，促进关节软骨的修复，但对软骨组织中iNOS的影响不大，如果与一氧化氮合酶抑制剂联合使用，将为OA的治疗提供一个新的前景。
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作者单位：岳阳市二人民医院骨科,湖南 岳阳 414000.