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【摘要】 目的 应用高效液相色谱法测定食品中氨基酸。方法 使用带自动衍生功能的自动进样器进行在线衍生，梯度分离，利用二极管阵列－荧光检测器串联分析。 结果 在线衍生技术克服了离线手工衍生的偏差，双检测器联用技术能有效提高定性的可靠性和定量的准确性。结论 研究的方法测定重复性好，灵敏度高，定性定量准确，结果满意。
【关键词】 高效液相色谱；氨基酸；食品
Determination of amino acids in foods by high performance liquid chromatography.
ZHONG Yue-tong, HE Cai, CHEN Chun-xiao.
(Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shenzhen 518020, Guangdong, P. R. China)
Abstract：Objective To determine amino acids from foods by high performance liquid chromatography. Methods Food samples were collected and determined by using autoinjector with online derivation function, gradient elution program and tandem detecting technicque. Results The online derivation technicque overcame the deviation arised from manual operating and serial detecting technicque could enhance both reliability and accuracy of determination. Conclusion The method is accurate, quatitatively and qualitatively as well as a reproductive and satisfactory results.
Key words：High performance liquid chromatography； Amino acids；Foods
氨基酸分析是食品成份分析的重要组成部分，其研究对象可分为生理体液和食品两大部分，检测方法一般可分为氨基酸分析仪法、离子色谱法、高效液相色谱法等。
氨基酸分析仪法操作简单。但是仪器价格很高。离子色谱仪法，其专用分析柱价格昂贵，且在分析食品时，实际样品与单纯的标准品会有较大的背景区别，结果可靠性低。在应用液相色谱法进行氨基酸分析时［1］，以往多采用离线手工衍生处理［2］，操作步骤繁琐、劳动强度大，结果重复性较差。本文使用了普通的市售衍生试剂，利用带自动衍生功能的自动进样器进行在线衍生［3］，处理后直接进样分析，消除了离线衍生进样时间不同和手工操作造成的误差，结果重复性好，操作处理简单，另应用了二极管阵列－荧光检测器联用技术，可一次测定食品中17种氨基酸，灵敏度高，准确性好，该方法可在各级食品检测机构推广应用。
1 材料与方法
1.1 仪器
1.1.1 液相色谱仪
美国安捷伦公司Agilent1100型（带在线脱气机，四元梯度泵，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器，荧光检测器）
1.1.2 pH计 EUTECH PH510型
1.1.3 电子天平 瑞士梅特勒 AE-200
1.1.4 数字显示烘箱 上海沪南科学仪器厂 202－1A型
1.2 试剂
1.2.1 甲醇、乙腈、四氢呋喃（色谱纯）
1.2.2 醋酸钠、冰醋酸、三乙胺（分析纯）
1.2.3 邻苯二甲醛（OPA）溶液：10mg/ml
1.2.4 氯甲酸芴甲酯（FMOC）溶液：2.5mg/ml乙腈溶液
1.2.5 硼酸缓冲溶液：浓度为0.4N，pH为10.4
1.2.6 氨基酸标准溶液（安捷伦公司提供，浓度分别为10、100、250、1 000pmol/μl）
1.3 流动相的配制方法
精确称量1.13g三水醋酸钠，转移入800ml玻璃杯中。 加500ml纯水，并搅拌至晶体全部溶解。加入120μl三乙胺并充分混合。通过滴入1%～2％的醋酸溶液，调节pH至7.31±0.05。加入1.8ml四氢呋喃，混匀，装入试剂瓶，得流动相A。另准确称取1.35g三水醋酸钠，转移入200ml玻璃杯中。加入100ml纯水，并搅拌至晶体全部溶解。通过滴入1%～2％的醋酸溶液，调节pH至7.20±0.05。将此溶液和200ml乙腈以及200ml甲醇混合均匀，装入试剂瓶，得流动相B。
1.4 液相色谱仪条件
1.4.1 色谱柱
Hypersil ODS 氨基酸分析柱, 长度 20cm，内径2.1mm
1.4.2 柱温：40.0 ℃
1.4.3 流速：0.45 ml/min
1.4.4 梯度洗脱程序(见表1) 。表1 梯度洗脱程序步骤时间（略）
1.4.5 自动进样器在线衍生程序
取三个洁净样品瓶，分别装入硼酸溶液、OPA试剂、FMOC试剂，在自动器瓶架上依次放置。设定进样针先抽取5.0μl 硼酸溶液，再抽取1.0μl OPA试剂，接着抽取1.0μl样品溶液，在反应管中混合6次；继续抽取1.0μl FMOC试剂，在反应管中混合6次后进样。
1.4.6 检测器参数切换程序
由于不同种氨基酸在二极管阵列检测器和荧光检测器的最佳检测波长不同，因此有必要在分析过程中对检测器参数进行切换，以达到最佳效果。具体见表2。 表2 二极管阵列检测器波长转换表(略)
1.5 样品前处理方法
（固体食品）准确称取均匀样品100mg左右，放于25ml的水解管中，再加入浓度为6mol/L的盐酸10～15ml，于110 ℃的恒温干燥箱内水解22h，冷却后用去离子水定量于50ml容量瓶中，供仪器测定用，标准和样品各进样20.0μl，以标准峰面积定量。（液体食品）准确称取样品1g左右，用0.05mol/L的盐酸定容至50ml。
2 结果与讨论
2.1 常用的氨基酸分析衍生处理的方法有邻苯二甲醛（OPA）衍生法、2,4－二硝基氟苯（FDNB）衍生法、异硫氰酸苯酯（PITC）衍生法、氯甲酸芴甲酯（FMOC）衍生法、6－氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）衍生法等。 为保证衍生效果，本方法在衍生过程中使用了OPA 和FMOC 两种试剂，其中，OPA 作为一级衍生剂，FMOC作为二级氨基酸衍生剂。17种氨基酸的标准色谱图见图1，具体数据详见表3 。表3 浓度为250p mol/L的17种氨基酸数据表序号英文缩写中文名称标准浓度（略）
2.2 在10～1 000pmol/μl的浓度范围内，二极管阵列检测器和荧光检测器均有良好的线性，相关系数在0.9988～0.9999之间，不同浓度的氨基酸重复试验的精密度均小于5％，当信噪比为3时，使用二极管阵列检测器的检测限为1～4pmol，使用荧光检测器检测限为0.5～2.5pmol（酪氨酸除外）。在测定液体样品时，回收率在90%～97％之间，效果理想；但是固体样品的回收率相对较低，在78%～89％之间，主要与样品状态和前处理有关。
2.3 使用邻苯二甲醛（OPA）衍生法的优点是衍生反应迅速，分辨率、灵敏度高，试剂成本低，且过量衍生试剂不干扰分离，但它同时存在着不能与二级氨基酸直接反应，衍生产物很不稳定的缺点。由于衍生产物衰减很快，而手工衍生操作至进样分析的时间和操作强度很难保证均一，这就是常规液相检测氨基酸的分析中测定结果不稳定的最主要因素。本方法使用氯甲酸芴甲酯（FMOC）作为二级氨基酸的衍生试剂，并且利用带全自动衍生功能的自动进样器进行在线衍生，衍生后直接进样分析，消除了离线衍生进样时间不同和手工操作造成的误差，不仅提高了准确性，而且降低了工作强度。
2.4 尽管荧光检测器的灵敏度高于二极管阵列检测器，但是它对于酪氨酸基本无响应，再考虑一般样品中的实际氨基酸含量用二极管阵列检测器足以满足，而且在串联检测器时，荧光检测器在二极管阵列之后，死体积较大，所以定量检测以二极管阵列检测器的结果为主；只有当样液浓度低于50pmol/μl时，才以荧光检测器数据定量，但酪氨酸仍然需以二极管阵列信号定量。
2.5 在分析氨基酸的实验中，一个普遍困难就是定性的问题，单纯以保留时间定性难以保证可靠。本方法应用联用方式，不仅以二极管阵列检测的特征吸收峰为依据定性，还以用两种性质不同的检测器对照响应值作为定性的参考，大大提高了定性的准确性。
2.6 在应用本方法时，流动相的配制是整个实验是否成功的关键所在。首先，在称量醋酸钠时，称重误差要小于0.025g；其次，要精确调节流动相的pH值，pH过低，会使缬氨酸和蛋氨酸的分离变坏，pH过高，不仅会使胱氨酸、缬氨酸等提前出峰，更会加速使色谱柱内的填料键合断裂流失，使得色谱柱很快失效。因此在调节中要认真仔细，并使用磁力搅拌机，在接近终点时需仔细逐滴加入，充分混匀后测取pH值后再加入。如pH调节过头必须重新从头配制，不可凑合使用；另外，在加入三乙胺时，应使用微量进样器准确加入。
2.7 在流动相中，三乙胺的实际含量虽然很低，但是对于分离的好坏却很关键，如果浓度稍低，会造成组氨酸和甘氨酸、胱氨酸和缬氨酸的分离不好。三乙胺很容易被氧化，多次开试剂瓶会造成实际浓度的降低。为了解决这个问题，可以在买来新的三乙胺后，尽快在充氮环境中分装在多个2ml棕色安瓿瓶中，并酒精喷灯封口后于避光阴凉处保存。每次实验时开一支，一次性使用，这样就能防止氧气的影响。
2.8 建议每次使用流动相都现配现用，不得保存，同样，衍生化试剂如OPA 、FMOC和硼酸溶液都需要每日更换。 建议购买安瓿瓶装商品化衍生试剂，放在冰箱冷藏保存，实验前各开一支。
2.9 本方法能够一次测定食品中的17种氨基酸，分析结果重复性好，灵敏度高，定性定量准确，并且不需要购买专用的氨基酸分析仪，检测试剂成本和前处理工作强度也都较低，可在各级食品检测单位中推广应用。
【参考文献】
［1］张毅平，张英，张仲平,等.香椿叶中氨基酸的分析研究［J］.中国现代应用药学杂志，2006，23（1）：30～32.
［2］罗晓健，吴志鹏，黄璐琦,等.氨基酸的柱前衍生高效液相色谱分析在中草药研究中的应用［J］.中草药杂志，2005，36（4）：630～632.
［3］Angelika Gratzfeld-Huegsge. sensiti and rialible amino acid analysis protein hydrolysates using the HP1100 series HPLC［R］,1999,2～4.
作者单位：深圳市疾病预防控制中心，广东 深圳 518020.