点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨氧化型脂蛋白(a)［Ox-Lp(a)］对大鼠肾小球系膜细胞（GMCs）增生及细胞间粘附因子-1（ICAM-1）表达的影响。方法 分离Lp(a) 并氧化修饰，培养GMCs，分别加入终浓度2.5、5、10、20nmol/L 的ox-Lp(a)作用12h, 终浓度5nmol/L 的ox-Lp (a) 作用12h、24h、48h、60h。采用MTT法测定GMCs增生率，免疫组化法检测GMCs的增生细胞核抗原（PCNA）阳性表达率，酶联免疫法检测培养液上清的ICAM-1浓度。并与加入终浓度5nmol/L的天然Lp(a)［n-Lp(a)］作用12h的Lp(a)组及不加任何刺激因素的空白对照组比较。结果 与对照组比较，Lp(a)组GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高，差异有统计学意义（P<0.01）。与Lp(a)比较，Ox-Lp(a)刺激后的GMCs MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高，且Ox-Lp(a)2.5nmol/L 作用高于终浓度5nmol/L的Lp(a)组（P<0.01）。随着Ox-Lp(a)浓度的增加，GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量呈明显变化，Ox-Lp(a)5nmol/L时达高峰，在Ox-Lp(a)10nmol/L组出现下降，20nmol/L明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。随着处理时间的延长，GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量呈上升趋势，48h达到高峰，60h出现下降（P<0.01）。GMCs上清的ICAM-1浓度与MTT和PCNA阳性表达率呈正相关（P<0.01）。结论 Lp(a)、Ox-Lp(a)能明显影响GMCs的增生，Ox-Lp(a)生物学作用强于Lp(a)。Ox-Lp(a)对GMCs的作用呈剂量依赖性和时间依赖性，小剂量时刺激GMCs的增生，大剂量则表现为细胞毒作用。Ox-Lp(a)明显影响大鼠GMCs 的ICAM-1表达，GMCs上清的ICAM-1浓度与MTT和PCNA阳性表达率呈正相关。提示Ox-Lp(a)对肾小球系膜细胞的作用可能与ICAM-1有关。
【关键词】 脂蛋白（a）；脂蛋白氧化；系膜细胞；增生细胞
Regulation of intercellular adhesion molecule-1 expression on murine glomerular mesangial cells by Oxidized lipoprotein(a).
XIANG Wei, HE Xiao-jie, XIE Hui-neng, et al.
1. Department of Peadiatrics, Hainan Provincial People's Hospital, Haikou 570311, Hainan, P.R. China
Abstract：Objective To investigate the effects of oxidized lipoprotein(a) ［Ox-Lp(a)］ on proliferation of glomerular mesangial cells (GMCs) and the experssion of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in rat model induced by lipopolysaccharide, and explore the possible mechanism of Ox-Lp(a) on the proliferation of rat GMCs. Methods The effect of Ox-Lp(a) with different doses of 2.5, 5, 10, and 20nmol/L on the proliferation of GMCs was observed. The rats of were divided into three groups: control group, Lp(a) group, Ox-Lp(a) group. After culture (at the end of 12h, 24h, 48h and 60h), the cultured GMCs and suspension were collected for observation of the proliferative rate of GMCs (MTT), the positive rate of proliferationg cell nuclear antigen (PCNA)(immuno-histo-chemisty), and ICAM-1 activity was determined with ELISA. Results At the end of experiment, compared with control and Lp(a) group , MTT, positive rate of PCNA and ICAM-1 activity of GMCs were more significantly higher in Ox-Lp(a) group; as for dosage-response, MTT, the positive rate of PCNA and ICAM-1 activity of GMCs were increased as Ox-Lp(a) doses increased, a maximal effect was seen for Ox-Lp(a) 5nmol/L group. Alon with the continuous increase［Ox-Lp(a) 10nmol/L］, MTT, the positive rate of PCNA and ICAM-1 activity of GMCs were decreased in Ox-Lp(a) group; As for time-response, MTT, the positive rate of PCNA and ICAM-1 activity were increased as Ox-Lp(a) dosage increased, a maximal effect was seen for Ox-Lp(a) cultured GMCs 48h. ICAM-1 activity showed positive correlation with MTT and the positive rate of PCNA. Conclusion Ox-Lp(a) can significantly affect the rate of GMCs proliferation, this effect is dosage-dependent and time-dependent. Small dosage can stimulate proliferation of GMCs, bigger dosage inhibit the proliferation of GMCs. Ox-Lp(a) can significantly affect ICAM-1 activity, too. ICAM-1 activity is positively correlated with MTT and the positive rate of PCNA .This suggests that the effect of Ox-Lp(a) on GMCs might be associated with ICAM-1.
Key words：Lipoprotein(a); Oxidative modificaton of lipoprotein ; Intercellular adhesion molecule-1; MTT ; Proliferationg cell nuclear antigen; Rat; Glomerular mesangial cells
已知多数肾脏疾病伴随脂代谢紊乱，且脂质异常能引起或加重肾损伤，是肾小球病变进展的重要危险因素之一［1］。脂蛋白(a)［Lipoprotein(a),Lp(a)］是一种特殊类型的脂蛋白，是冠心病、动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）的独立危险因素。研究表明Lp(a)发生氧化后可转变为氧化型Lp(a)［Ox-Lp(a)］，其生物学特性可发生明显变化［2］。我们既往研究发现难治性肾病综合征患儿存在血脂代谢紊乱及载脂蛋白E基因多态性的异常，且与Lp(a)相关联［3,4］。已有研究发现Lp(a)在血管内膜下易被氧化［5］。但Ox-Lp(a)对与肾脏疾病进展密切相关的肾小球系膜细胞（Glomerular mesangial cells,GMCs）的作用及可能机制尚未见报道。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 大鼠GMCs培养［6］
从液氮罐内取出大鼠GMCs系，37℃水浴后离心，吸出细胞液，移入细胞培养瓶静置培养，培养液由20%胎牛血清、0.3U/ml胰岛素、100U/ml青霉素、100mg/L链霉素、2.5mg/L二性霉素及D-缬氨酸改良的伊格尔培养基（Minimum Essential Medium，MEM）组成。培养瓶置于5% CO2、18%O2孵箱内。当系膜细胞长至贴壁时，用0.25%胰蛋白酶与0.04%乙二胺四乙酸二钠等量混合，消化细胞，传代。笫3代时，用RPMI 1640代替D-缬氨酸改良的MEM，其他成分相同。
1.1.2 天然Lp(a)［n-Lp(a)］分离及Ox-Lp(a)制备［7］
通过采用肝素体外LDL沉淀法定期进行LDL血浆置换患者的富含Lp(a)再生液，行超速离心（密度1.065～1.120mg/ml），再予密度梯度离心法分离。获取的 Lp(a) 经150mmolNaCl、1mmol/L EDTA（pH 7.4）于4℃透析48h后，微孔过滤膜除菌，Sephader G 25M 凝胶层析和赖氨酸-seppharose 4B层析纯化，采用0.6%琼脂糖凝胶电泳和4%的SDS-PAGE鉴定并分析纯度。储存备用。加入终浓度为10μmol/ L的CuSO4 37℃温育24h使Lp(a)氧化。在0.01mol/LPBS溶液中透析24h后测定丙二醛浓度作为硫代巴比妥酸反应物质(TBARS) 的浓度。
1.2 方法
1.2.1 MTT法测定大鼠GMCs增生率
将GMCs种入96孔板中，2×104个细胞/孔，分对照组、Lp(a)组、Ox-Lp(a)组共3组，Ox-Lp(a)组分别加入终浓度2.5、5、10、20nmol/L的ox-Lp(a)作用12h, 终浓度5nmol/L的ox-Lp(a)作用12h、24h、48 h、60h。Lp(a)组加入n-Lp(a)（5nmol/L，作用12h），不加任何刺激因素作为空白对照组。实验末分别测定GMCs增生率。细胞增生率=（LPS组吸光度-实验组吸光度）/LPS组吸光度。
1.2.2 GMCs中增生细胞核抗原（Proliferationg cell nuclear antigen，PCNA）表达的测定
GMCs分瓶培养，实验末，收集培养细胞，涂片，丙酮固定，免疫组化法测定PCNA表达。实验结果在显微镜下观察，分别计数每张涂片中的5个视野内（200个/每视野）GMCs的免疫染色阳性细胞数，计算其阳性率。
1.2.3 细胞间粘附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的测定
采用ELISA法（试剂盒购自南京建成生物工程有限公司）。
1.3 统计学分析
所有计量资料均采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验或方差分析，并行相关分析。以P<0.05为有统计意义。
2 结果
2.1 Ox-Lp(a)对GMCs增生及ICAM表达影响的时间效应
见表1，在对照组、Lp(a)组及Ox-Lp(a)各亚组［终浓度5nmol/L的ox-Lp(a)作用12h、24h、48h、60h］，GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量均有明显变化，经F检验，差异有显著性（P<0.01）。表1 Ox-Lp(a)对GMCs增生及ICAM表达影响的时间效应（略）
与Lp(a)组比较，Ox-Lp(a)12h组GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高，两两之间的q检验，差异有显著性（P<0.01）。
在Ox-Lp(a)各亚组，随着处理时间的延长，GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量呈上升趋势，Ox-Lp(a)24h组高于12h组，Ox-Lp(a)36h组高于24h组，Ox-Lp(a)48h组高于36h组，Ox-Lp(a)48h达到高峰，Ox-Lp(a)60h组出现下降，低于Ox-Lp(a)48h组，经两两之间的q检验，除Ox-Lp(a)48h与36h组的MTT，Ox-Lp(a)48h与60h组的培养上清ICAM-1含量无统计学差异外，余差异均有显著性（P<0.01）。
2.2 Ox-Lp(a)对GMCs增生及ICAM表达影响的剂量效应
见表2，在对照组、Lp(a)组及Ox-Lp(a)各亚组［终浓度2.5、5、10、20nmol/L的ox-Lp(a)作用12h］，GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量均有明显变化，经F检验，差异有显著性（P<0.01）。表2 Ox-Lp(a)对GMCs增生及ICAM表达影响的剂量效应（略）
与Lp(a)组［终浓度5nmol/L的n-Lp(a)，作用12h］比较，Ox-Lp(a)2.5nmol/L作用12h，GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高，差异有显著性（P<0.01）。
在Ox-Lp(a)各亚组，随着Ox-Lp(a)浓度的增加，GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量呈明显变化，Ox-Lp(a)5nmol/L组高于2.5nmol/L组，GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量在Ox-Lp(a)10nmol/L组出现下降，低于5nmol/L组，20nmol/L低于10nmol/L组，经两两之间的q检验，差异均有显著性（P<0.01）。
2.3 相关性分析
从剂量效应来看，n-Lp(a)组及Ox-Lp(a)各亚组［终浓度2.5、5、10、20nmol/L的ox-Lp(a)作用12h］PCNA阳性率及培养上清ICAM-1浓度与反映系膜细胞增生指标的MTT呈正相关［相关系数从0.68～0.92，P均<0.01］。
从时间效应来看，n-Lp(a)组及Ox-Lp(a)各亚组［终浓度5nmol/L的ox-Lp(a)作用12h、24h、48h、60h］PCNA阳性率及培养上清ICAM-1浓度与反映系膜细胞增生指标的MTT呈正相关［相关系数从0.74～0.86，P均<0.01］。
ICAM-1与PCNA阳性率相关性分析：从剂量效应来看，培养上清ICAM-1浓度与PCNA阳性率呈正相关［相关系数从0.78～0.94，P均<0.01］。从时间效应来看，培养上清ICAM-1含量与PCNA阳性率呈正相关［相关系数从0.81～0.96，P均<0.01］。
3 讨论
随着肾替代治疗的进展，肾脏疾病患者长期生存率的提高，终末期肾病（ESRD）发病率逐渐增高，从而引起人们对慢性肾功能不全的病理生理和治疗的关注。近年来研究表明肾小球硬化与AS在组织形态上的改变及发病机制上存在相似性。GMCs增殖在肾小球硬化中扮演了极其重要的作用［1,8］。系膜细胞增殖和细胞外基质分泌增多是肾小球硬化最重要的前期表现之一。系膜细胞增殖的机制尚不十分清楚，可能与多种因素有关，脂质代谢紊乱也与其密切相关［1,8,9］。动物实验已证实低密度脂蛋白能直接刺激GMCs增殖和基质增多致肾小球硬化形成［9］。
Lp(a)是1963年由Berg利用免疫方法发现的一种新的脂蛋白，其密度在低密度脂蛋白和高密度脂蛋白之间，为1.050～1.100g/ml。Lp(a)与低密度脂蛋白相比，在化学结构上十分相似，含有类似的脂质核心和载脂蛋白B，但比低密度脂蛋白多含一个载脂蛋白(a)，二者之间以二硫键结合，此在其他任何脂蛋白中都不存在。Lp(a)的密度比低密度脂蛋白大（1.065g/ml），颗粒也稍大（25.0nm），Lp(a)与低密度脂蛋白不一样，不是由中间密度脂蛋白在肝脏内转化而来，也不能转化为其他的脂蛋白，系一类独立的脂蛋白［10］。Lp(a)已被认为是心脑血管AS及动脉再狭窄的独立危险因素，Lp(a)和纯化的载脂蛋白(a)可促进平滑肌细胞生长，而此为AS病灶产生的重要事件之一。并且Lp(a)对血液纤维蛋白的溶解有一定影响，Lp(a)可明显增加α-抗纤维蛋白溶解酶的抑制作用，而间接影响纤维蛋白溶解酶原的活性，有促血栓形成的作用，估计也参与了AS的形成。血浆Lp(a)水平升高是肾脏疾病和终末期肾病的共同特征，并加速肾功能的丧失，提示Lp(a)可能与肾脏疾病的发生发展密切相关［8］。本研究发现与对照组比较，Lp(a)组GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高，差异有统计学意义，提示Lp(a)能明显影响肾脏系膜细胞的增生。
脂蛋白氧化修饰是近年来的研究热点，已观察到体外Lp(a)可发生氧化修饰，初步研究提示Ox-Lp(a)的生物学作用明显大于未氧化修饰的Lp(a)。Lp(a)在体内被氧化修饰后，易被巨噬细胞－清道夫受体识别和摄取，导致细胞内胆固醇酯的蓄积及泡沫细胞的形成，损伤组织细胞，参与AS的病理过程。有研究发现Ox-Lp(a)能诱导内皮细胞巨噬细胞炎性蛋白1α表达增强,而n-Lp(a)表达不明显［7］。本研究发现与Lp(a)比较，Ox-Lp(a)刺激后的GMCs MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高，且Ox-Lp(a) 2.5nmol/L作用高于终浓度5nmol/L的n-Lp(a)。提示Lp(a)发生氧化修饰后，其生物学作用可发生明显变化。
MTT是目前检测细胞增生程度的一种常用方法，代表与实验前相比细胞增生了多少。PCNA是一种细胞周期调控蛋白，是细胞增殖时所需要的DNA聚合酶辅助蛋白，通常用来作为判断肾脏疾病细胞增生的标志物，也是反映细胞增生的一种指标，与MTT结合能更准确的反映细胞增生程度。我们研究发现随着Ox-Lp(a)浓度的增加，GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率呈明显变化，Ox-Lp(a)5nmol/L组高于2.5nmol/L组，GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率在Ox-Lp(a)10nmol/L组出现下降，低于5nmol/L组，20nmol/L低于10nmol/L组，差异有统计学意义。随着处理时间的延长，GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率呈上升趋势，Ox-Lp(a)24h组高于12h组，Ox-Lp(a)36h组高于24h组，Ox-Lp(a)48h组高于36h组，Ox-Lp(a)48h达到高峰，Ox-Lp(a)60h组出现下降，低于Ox-Lp(a)48h组。相关性分析发现从时间效应来看，PCNA阳性率与反映系膜细胞增生指标的MTT呈正相关，从剂量效应来看，PCNA阳性率与MTT也呈正相关。以上结果说明Ox-Lp(a)能明显影响肾脏系膜细胞的增生，作用呈剂量依赖性及时间依赖性，小剂量时刺激系膜细胞的增生，大剂量则表现为细胞毒作用。
细胞粘附分子是一类能介导细胞间以及细胞与细胞外基质粘附的糖蛋白，粘附分子在AS发病中起着一定的作用。Anne H等人发现在高胆固醇血症和高甘油三酯血症患者血可溶性ICAM-1水平明显升高。研究发现粘附分子及其粘附机理可能是介导肾炎时细胞浸润和增殖、细胞外基质扩张乃至肾小球硬化的分子基础［11,12］。肾小球MC表面有低表达的ICAM-1［11,12］。
我们研究发现随着Ox-Lp(a)浓度的增加，GMCs培养上清ICAM-1含量呈明显变化，Ox-Lp(a)5nmol/L组高于2.5nmol/L组，在10nmol/L组出现下降，低于5nmol/L组，20 nmol/ L低于10nmol/L组。随着处理时间的延长，GMCs培养上清ICAM-1含量呈上升趋势，Ox-Lp(a)48h达到高峰，Ox-Lp(a)60h组出现下降。且Ox-Lp(a)组GMCs培养上清ICAM-1含量明显高于Lp(a)组。从时间和剂量效应来看，ICAM-1浓度均与反映系膜细胞增生指标的MTT和PCNA阳性率呈正相关。说明Ox-Lp(a)可能通过ICAM-1而影响系膜细胞增生，此值得进一步研究。
小儿原发性肾小球疾病是临床上常见疾病之一，如其肾小球病变不断加重，最终可导致肾小球硬化、肾功能丧失。现在儿童慢性肾脏疾病/ESRD发病率及病死率不仅与慢性肾损害和肾替代治疗有关，而且与心血管疾病危险因素长期暴露导致心血管疾病的发生有关。心血管疾病现在是成人ESRD死亡的主要原因，也占儿童ESRD死亡的1/4，在儿科ESRD患者，已发现AS的亚临床证据，在动脉内膜出现斑块，在肾移植患儿，髂动脉活组织检查发现AS病变［13］。我们研究发现肾脏疾病常伴随脂代谢紊乱， Lp(a)、Ox-Lp(a)均明显影响肾小球系膜细胞增殖，Ox-Lp(a)生物学活性明显强于Lp(a)，此可能与ICAM-1相关联。最终导致肾小球内皮细胞损伤、系膜细胞增殖、肾脏疾病进展乃至肾小球硬化。因此积极处理肾脏疾病伴发的脂质代谢紊乱，阻断ICAM-1的作用，有效控制系膜细胞异常增生，即能延缓肾脏病的慢性进展。
【参考文献】
目的 探讨氧化型脂蛋白(a)［Ox-Lp(a)］对大鼠肾小球系膜细胞（GMCs）增生及细胞间粘附因子-1（ICAM-1）表达的影响。方法 分离Lp(a) 并氧化修饰，培养GMCs，分别加入终浓度2.5、5、10、20nmol/L 的ox-Lp(a)作用12h, 终浓度5nmol/L 的ox-Lp (a) 作用12h、24h、48h、60h。采用MTT法测定GMCs增生率，免疫组化法检测GMCs的增生细胞核抗原（PCNA）阳性表达率，酶联免疫法检测培养液上清的ICAM-1浓度。并与加入终浓度5nmol/L的天然Lp(a)［n-Lp(a)］作用12h的Lp(a)组及不加任何刺激因素的空白对照组比较。结果 与对照组比较，Lp(a)组GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高，差异有统计学意义（P<0.01）。与Lp(a)比较，Ox-Lp(a)刺激后的GMCs MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高，且Ox-Lp(a)2.5nmol/L 作用高于终浓度5nmol/L的Lp(a)组（P<0.01）。随着Ox-Lp(a)浓度的增加，GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量呈明显变化，Ox-Lp(a)5nmol/L时达高峰，在Ox-Lp(a)10nmol/L组出现下降，20nmol/L明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。随着处理时间的延长，GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量呈上升趋势，48h达到高峰，60h出现下降（P<0.01）。GMCs上清的ICAM-1浓度与MTT和PCNA阳性表达率呈正相关（P<0.01）。结论 Lp(a)、Ox-Lp(a)能明显影响GMCs的增生，Ox-Lp(a)生物学作用强于Lp(a)。Ox-Lp(a)对GMCs的作用呈剂量依赖性和时间依赖性，小剂量时刺激GMCs的增生，大剂量则表现为细胞毒作用。Ox-Lp(a)明显影响大鼠GMCs 的ICAM-1表达，GMCs上清的ICAM-1浓度与MTT和PCNA阳性表达率呈正相关。提示Ox-Lp(a)对肾小球系膜细胞的作用可能与ICAM-1有关。