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【摘要】 目的 克隆人PRL-3基因并构建其真核表达载体,并运用生物信息学方法对PRL-3的相互作用蛋白进行预测分析。方法 运用RT-PCR技术，从人大肠癌细胞系SW480细胞中扩增出人PRL-3 cDNA，经T-A克隆，构建人PRL-3基因的真核表达载体pcDNA3-PRL-3，通过双酶切鉴定及测序确认，并利用生物信息学方法预测分析其相互作用蛋白。 结果 成功扩增出人PRL-3全长cDNA,构建pcDNA3-PRL-3真核表达载体，测序结果表明PRL-3全长cDNA与GeneBank中PRL-3序列完全一致。利用模式生物果蝇相互作用蛋白数据库DIP，利用基于保守的蛋白相互作用分析方法，预测认为肌动蛋白家族成员ARP6和功能尚不清楚的小G蛋白家族ARL-3可能是PRL-3的相互作用蛋白，提示PRL-3可能是联系信号分子和细胞骨架系统的重要桥梁，参与构建了一条独特的结直肠癌转移信号途径。结论 成功克隆PRL-3基因全长cDNA并构建其真核表达载体，并利用生物信息学方法，初步预测PRL-3的相互作用蛋白，为进一步深入研究PRL-3在大肠癌发生发展中的作用奠定了基础。
【关键词】 PRL-3；蛋白相互作用； 生物信息学
Construction of PRL-3 gene eukaryotic expression vector and bioinformatic analysis of PRL-3-interacting proteins.
ZHOU Jun, LI Jian-ming, YANG Fa-da, et al.
Department of Pathology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong, P. R. China
Abstract：Objective To clone entirely coding human PRL-3 gene and construct its recombinant eukaryotic expression vector so as to explore its function and roles in metastasis of the human colorectal carcinoma. Methods With total RNA extracted from the human colorectal carcinoma cell sw480 as template, PRL-3 gene was amplified by RT-PCR with the designed primers based on the public sequence of GeneBank, and then inserted into pGEM-T Easy vector by TA cloning. Recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3-PRL-3 was then constructed by subcloning technique and confirmed by restriction enzyme digestion analysis and sequencing. Bioinformatical methods were used to predict and analyze PRL-3-interacting proteins, and gene expression patterns of the candidate proteins in human tissues or organs were analyzed by Digital northern blot in NCBI online database. Results The entirely coding human PRL-3 gene was cloned. Recombinant pcDNA3-PRL-3 was successfully constructed. Bioinformatics analyses indicated that PRL-3 was found as an important bridge between ARL-3 protein and ARP6 protein. Gene expression patterns of PRL-3 and its related proteins in human tissues or organs were found similar by use of digital northern blot in online NCBI database. Conclusion Human PRL-3 gene has been successfully cloned and ARL-3 protein and ARP6 protein are predicted to be PRL-3-interacting proteins， which will be useful for further research on its function as well as its implications in the occurrence and progress of colorectal carcinoma.
Key words：PRL-3 Gene; Protein interaction; Bioinformatics
蛋白酪氨酸磷酸酶-3(Phosphatase of regenerating liver-3 PRL-3) 是一种分子量只有20KD的蛋白磷酸酶，属于PRL家族，该家族只有三个成员PRL-1、PRL-2、及PRL-3［1］。新近的一些研究表明PRL-3与肿瘤转移有非常密切的关系。作为一个潜在新的肿瘤治疗靶点已成为一个新的研究热点，但就目前而言，对于PRL-3仍有两大难题急需解决，首先，PRL-3活性的生理性靶标或底物不明。其次，PRL-3参与哪些细胞信号通路仍不清楚，这些问题的解答将有利于揭示PRL-3的功能特性，而寻找PRL-3的相互作用蛋白则可能为这些问题的解决提供线索。因此，本研究中我们首先克隆人PRL-3基因，构建其真核表达载体，通过PCR、限制性酶切分析以及测序鉴定，然后应用生物信息学方法对PRL-3相互作用蛋白进行初步预测，寻找PRL-3相互作用蛋白，为进一步研究了解PRL-3蛋白在结直肠癌转移中的作用机制以及相关的信号通路奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
Trizol试剂和RT-PCR 试剂盒为Invitrogen公司产品；克隆载体pGEM-T Easy Vector、AMV逆转录酶为Promiga公司产品；PrimeSTAR HS DNA高保真酶、限制性内切酶、T4连接酶、标准分子量DNA Marker、质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒均购自Takara公司；pGEX-4T-1、sw480人大肠癌细胞、大肠杆菌DH5、BL21(DE3) 菌株均由为本室保存。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成
根据已报道的PRL-3基因序列(GeneBank Accession Number: NM_032611) ,依据PCR引物设计原则和PrimeSTAR HS DNA高保真酶的特性，利用在线引物设计工具（http://seq.yeastgenome.org/cgi-bin/web- primer）设计能特异性扩增人PRL-3 cDNA全长的引物序列，同时分别在上游引物P1和下游引物P2的5′端引入BamH 1和Xho l两酶切位点，引物由上海英骏生物技术有限公司合成, 序列如下:
P1：5’-GGATCCATGGCTCGGATGAACCGC-3’
P2：5’-CTCGAGCTACATAACGCAGCACCGGGT-3’
1.2.2 RT-PCR
取适量培养的大肠癌细胞株sw480,加入1ml TRIzol试剂,提取总RNA,以2μg总RNA为模板,按照试剂盒说明书进行反转录获得cDNA，以cDNA产物为模板, P1和P2为引物, PCR扩增约522bp的片段, 总反应体积为50μl, 循环参数为:94℃ 2min；94℃ 20s, 56℃ 20s, 72℃ 40s, 30个循环,72℃延伸5min。取5μl PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.3 PRL-3基因序列测定
PRL-3扩增产物使用Agarose Gel DNA Purification Kit回收DNA，经加A尾处理后，插入克隆载体pGEM-T Easy载体中，构建pGEM-T-PRL-3, 然后转化DH5a感受态,涂LB板（Amp+）后,次日随机挑取5个克隆, 37℃振荡培养12h,小量提取质粒pGEM-T-PRL-3，经PCR及BamH 1和Xho Ⅰ双酶切鉴定,鉴定正确的质粒交由上海英骏生物技术有限公司进行DNA序列测定。
1.2.4 pcDNA3-PRL-3真核表达载体的构建
pcDNA3和pGEM-T-PRL-3分别用BamH Ⅰ 和Xho Ⅰ双酶切后, 琼脂糖电泳回收载体大片段和目的片段；连接上述目的基因和载体片段，构建pcDNA3-PRL-3真核表达载体，转化DH5α感受态细胞，用含Amp+的LB平板筛选阳性克隆，小量抽提质粒，经PCR及BamH Ⅰ 和Xho Ⅰ双酶切鉴定并进行测序分析。
1.2.5 不同种属PRLs家族成员进化树分析
利用NCBI在线数据库，对PRL-3进行Blast分析，寻找其直系及旁系同源蛋白，进一步我们对不同种属包括酵母、线虫、果蝇、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、猕猴以及人等PRLs家族成员应用在线分析软件Clustal W进行进化树分析(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/#)。
1.2.6 利用模式生物果蝇相互作用蛋白数据库，寻找果蝇中PRL相互作用蛋白
利用在线的模式生物果蝇相互作用蛋白数据库DIP (http://dip.doe-mbi.ucla.edu/)，分析果蝇PRL(dPRL-1)相互作用网络，寻找果蝇中PRLs相互作用蛋白。
1.2.7 人类PRL-3相互作用蛋白的预测
利用在线数据库寻找果蝇中PRL相互作用蛋白的人类的同源蛋白 (http://www.ensembl.org/index.html, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，对人类PRL-3的相互作用蛋白进行初步分析预测，对其可能的功能进行初步分析。
1.2.8 虚拟Northern杂交分析PRL-3及预测的相互作用蛋白的表达
利用CGAP中的SAGE和cDNA数据库（http://cgap.nci.nih.gov/Genes）对PRL-3及预测的相互作用蛋白基因在正常组织和各种肿瘤细胞中的表达情况进行虚拟Northern杂交分析。
2 结果
2.1 人PRL-3cDNA基因的扩增、克隆及序列测定
PCR成功扩增出人PRL-3基因片段，PRL-3基因PCR产物的电泳结果可见大小为522bp左右的特异性条带(图1)。电泳回收片段插入pGEM-T Easy克隆载体中,形成pGEM-T-PRL-3, BamH 1和Xho Ⅰ双酶切鉴定得到正确克隆，克隆测序结果与GeneBank里的人PRL-3基因序列相一致(图2)。
2.2 真核表达载体pcDNA3-PRL-3的构建及鉴定
构建的质粒用BamH 1和Xho l双酶切鉴定,得到约5.4kb和522bp左右的片段,与预期结果一致(图3)。
2.3 PRL-3相互作用蛋白的生物信息学研究
2.3.1 不同种属PRLs家族成员进化树分析
利用NCBI在线数据库我们寻找到包括酵母、线虫、果蝇、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、猕猴以及人等不同种属的PRL-3蛋白的直系及旁系同源蛋白。应用在线分析软件ClustalW，对不同种属的PRLs家族成员进行进化树分析，结果见图4。我们观察到人PRL-3(hPRL-3)与果蝇PRL(dPRL-1)接近，实际上在果蝇中PRL只有一个成员即dPRL-1，这提示PRL-3在进化上的保守性。
2.3.2 模式生物果蝇中PRLs相互作用蛋白的确定
利用在线的模式生物果蝇相互作用蛋白数据库DIP，分析果蝇PRL(dPRL-1)相互作用蛋白的网络，寻找果蝇中PRLs相互作用蛋白，结果见图5。结果发现这一网络非常独特，dPRL-1是联系果蝇蛋白CG11678-1A和CG17819-PA两者间的重要桥梁。
2.3.3 人类PRL-3相互作用蛋白的预测
根据确定的模式生物果蝇中PRL(dPRL-1)相互作用蛋白序列，利用在线数据库，寻找果蝇中PRL(dPRL-1)相互作用蛋白的人类的同源蛋白，结果发现，人类中与CG11678-1A同源的蛋白是ARP6(actin-related protein 6 homolog)，而与CG17819同源的蛋白是ADP-ribosylation factor-like protein家族成员ARL-3，这些同源蛋白之间都具有较高的同源性，而且具有较为一致的作用域。
2.3.4 数字Northern杂交分析PRL-3及预测的相互作用蛋白的表达
利用CGAP中的SAGE和cDNA数据库（http://cgap.nci.nih.gov/Genes）对PRL-3及预测的相互作用蛋白基因在正常组织和各种肿瘤细胞中的表达情况进行数字Northern杂交分析(表1及图6)。结果发现ARP6、ARL-3与PRL-3的基因表达谱非常接近，与PRL-1及PRL-2的基因表达谱则差别明显，而且也注意到PRL-3在正常结直肠粘膜组织中未有表达，而在结直肠癌细胞系HT29、SW620、HCT116以及COLO205中都有较高的表达。表1 PRL-3 相关蛋白在正常组织中的表达情况（略）
3 讨论
我们通过克隆构建PRL-3真核表达载体，并利用生物信息学技术对其相互作用蛋白进行了初步预测，为进一步研究其功能和在结直肠癌转移中的作用创造条件。本实验采用分子克隆技术构建PRL-3的真核表达载体，以期采用基因转染和表达方法，探讨其在肿瘤中的作用。
随着计算机科学的发展，生物信息学目前已成为研究蛋白质相互作用方法中除了传统的基于分子生物学方法之外的重要补充。生物信息学是一门数学、统计、计算机与生物医学交叉结合的新兴学科，已广泛地渗透到医学的各个研究领域中，是现代生物医学发展不可缺少的重要工具，在人类疾病与功能基因的发现与识别、基因与蛋白质的表达与功能研究以及对蛋白质的相互作用的预测分析等方面都发挥着关键的作用。生物信息学预测蛋白相互作用的方法依据不同的原理可分为多种，如系统发育谱（Phylogenetic profile），基因邻接（Gene neighborhood），镜像树 (Mirrotree)，突变关联(Correlated mutation)，保守的蛋白间相互作用(Interologs)等方法，其中保守的蛋白间相互作用方法依据的原理是相互作用的蛋白质在物种演化过程中具有保守性。因此，通过在一个物种中建立的蛋白质相互作用网络，可以预测其它物种相应同源蛋白质间的相互作用［2,3］。
PRL-3蛋白与结直肠癌转移的关系已经确定［4］，但目前我们仍不了解PRL-3活性的生理性靶标或底物，也没有掌握促进细胞迁移和侵袭的具体机制。PRL-3本身只是一个小分子蛋白质，结构相对简单，除了酶活性结构域和异戊烯化位点外，无其它的活性区。根据PRL-3的分子结构分析，结合其它特异性的磷酸酶功能特性，其功能特征可能取决于它结合的蛋白质结构和功能［5］，寻找确定PRL-3的相互作用蛋白将可以为这些问题的解决提供线索和提示。
鉴于模式生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的蛋白相互作用数据库已经建立［6］，我们采用基于保守的蛋白间相互作用的生物信息学预测方法，通过分析确定果蝇中CG11678-1A和CG17819-PA两蛋白为dPRL-1的相互作用蛋白，再通过在线数据库寻找确定人类与此二者同源的蛋白为ARP6（Actin-related protein 6 homolog）和ADP-ribosylation factor-like protein家族成员ARL-3，这些同源蛋白之间都具有较高的同源性，而且具有较为一致的保守结构域。同时根据CGAP的SAGE和cDNA数据库，我们对PRL-3、ARP6及ARL-3基因在正常组织和各种肿瘤细胞系中的表达情况进行了虚拟Northern杂交分析，结果发现ARP6、ARL-3与PRL-3的基因表达谱非常接近，与PRL-1及PRL-2的基因表达谱则差别明显，而且也注意到PRL-3在正常结直肠粘膜组织中未有表达，而在结直肠癌细胞系HT29、SW620、HCT116以及COLO205中都有较高的表达。根据这些结果，我们推测ARP6和ARL-3蛋白很可能与其在酵母中的同源蛋白相似，与人类PRL-3存在相互作用。
ARP6是肌动蛋白家族成员，其家族成员主要参与细胞骨架调节，目前对其研究相关报道还不多见，有研究表明其家族成员ARP2的高表达与结直肠癌的肝转移发生关系密切［7,8］，而ARP2与WAVE2 (Wiskott-Aldrich syndrome family verproline-homologous protein 2)的高表达也可以促进乳腺癌及肺癌转移发生［9,10］。ARL-3则属于功能尚不清楚的小G蛋白家族，目前对于它的研究也少见报道，有研究表明ARL-3的缺乏与上皮细胞不正常的增殖有关［11］，而另有报道认为其家族另一成员ARL-2与细胞周期、微管蛋白变形和微小管的动力学有关［12］。这些研究结论在某种程度上对解释PRL-3在肿瘤转移中的机制提供了有益的提示。
通过上述预测分析，我们推测，PRL-3可能是联系信号分子和细胞骨架系统的重要桥梁，参与构建了一条独特的结直肠癌转移信号途径，但这仅是基于生物信息学预测结果的一种推测，还需后续的实验去证实，而寻找确定PRL-3相互作用蛋白，将为证实这一推测乃至最终阐明PRL-3功能特性起到至关重要的作用。
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